中药化学成分透血脑屏障研究中MDCKpHaMDR细胞模型和操作规程建立.docVIP

中药化学成分透血脑屏障研究中MDCKpHaMDR细胞模型和操作规程的建立 　　[摘要]建立MDCKpHaMDR细胞模型和标准操作规程，用于评价中药化学成分透血脑屏障的吸收转运。通过MDCKpHaMDR单层细胞的电镜下形态学特征、跨膜电阻、罗丹明1.2.3的胞内蓄积和双向转运以及阳性对照药咖啡因和阿替洛尔的转运程度等指标对MDCKpHaMDR细胞模型进行评价。MDCKpHaMDR细胞模型具有良好的完整性、紧密性和Pgp的稳定表达，阳性药物的转运结果与文献值一致。建立的MDCKpHaMDR细胞模型的各项指标均符合要求，可用于中药化学成分透血脑屏障的吸收转运研究。 　　[关键词]MDCKpHaMDR细胞； 中药化学成分； 血脑屏障； 吸收转运 　　近年来，中枢神经系统（central nervous system，CNS）疾病的发病率不断增加，尤其是面对社会老龄化人数的迅速增加，严重影响了人类的生存质量，中药及复方用于脑病治疗越来越普遍，同时脑靶向性给药也越来越受到重视。药物对脑病的治疗有多种途径，其中透过血脑屏障（bloodbrain barrier，BBB）进入脑内是发挥药物作用的重要前提。BBB是存在于血液系统与脑组织之间的屏障系统，它的存在有利于维持脑内环境的相对稳定，但同时也阻碍了药物向脑内的递送，成为脑部疾病治疗的主要阻碍。解剖学上，BBB是一层连续的、覆盖在99%脑毛细血管表面的内皮细胞膜，由3部分组成，最内层为脑毛细血管内皮细胞及其紧密连接，中间为基质和周细胞，最外层是星形胶质细胞和细胞外基质，其中脑微血管内皮细胞是构成BBB结构的基础。在毛细血管内皮细胞膜和紧密连接上分布有很多物质转运载体（如P糖蛋白，Pgp）[1]等。随着BBB吸收转运及Pgp功能相关研究工作的深入开展，体外BBB模型因其便利性越来越成为研究药物向脑内递送的最佳工具。最典型的体外BBB模型是原代培养的脑微血管内皮细胞单独培养[2]或与星型胶质细胞共培养[3]，各有优缺点，如单独培养脑微血管内皮细胞会逐渐丧失BBB的特性，而在培养体系中加入星形胶质细胞后能够较好地模拟体内环境，可以较好地保留BBB的特性[45]。因此，采用微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养模型模拟BBB更常用。但是，由于每次实验都要从动物脑取脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞，且原代培养操作要求较高，实验结果重现性差，因此其推广使用受限。近年来转染了多药耐药（multidrug resistant，MDR）基因的犬肾细胞系（madindarby canine kidney cell line，MDCK）已被证实具有BBB的相关结构特征[67]，已用于研究药物的BBB吸收[89]。MDCKpHaMDR细胞系由MDCK细胞感染了PA1.2MDR1/A1细胞系的MDR1病毒后形成，具有稳定的Pgp表达以及与脑内皮细胞相似的结构特征[10]，同时具有操作简单、易于培养、生长周期短等优点，可作为体外血脑屏障模型应用[7]。本研究建立用于中药化学成分透血脑屏障研究的MDCKpHaMDR体外细胞模型及研究其吸收转运的操作规程。 　　1材料 　　Galaxy B型CO2气体培养箱（英国RS Biotech公司）；Evom细胞电阻仪（World Precision Instrument， Sarasota，FL）；JEM1.2.30型透射式电子显微镜（日本电子株式会社，东京都，日本）；XDS1倒置显微镜（重庆光电仪器公司）；STIK高压蒸气灭菌器（上海施都凯仪器设备有限公司）；GRX905.1B型热空气消毒箱（上海福玛实验设备有限公司）；HZSH型恒温水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；TGL1.6C 型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；Cary Eclipse荧光分光光度计（Varian Inc，CA，USA）；Agilent 1.2.60 高效液相色谱仪（Agilent，CA，USA）；1.2孔聚碳酯膜转运板Transwell（Lot #3.402，嵌套直径1.2 mm，膜孔径 3 μm），2.5 cm2及75 cm2细胞培养瓶均购自美国Corning Costar公司（Cambridge， MA， USA）；细胞培养所用DMEM（Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，Lot#1.2.3.73.1.7）高糖培养基，胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS，Lot # 9892.67），02.5%胰蛋白酶EDTA（TrypsinEDTA）均购自美国Gibco公司（Grand Island， NY， USA）；青链霉素混合液（Lot # 201.2.1009）购自北京索莱宝科技有限公司。 　　阿替洛尔、二甲基亚砜（DMSO）、罗