人FOXA1蛋白原核表达纯化及蛋白互作分析.docVIP

人FOXA1蛋白的原核表达、纯化及蛋白互作分析 　　摘要：构建FOXA1的原核表达载体，诱导表达并纯化后获得人FOXA1的C端和N端蛋白片段，为寻找FOXA1的互作蛋白提供材料基础.提取人乳腺癌细胞MCF7的总RNA，逆转录成cDNA，设计引物PCR克隆FOXA1的cDNA，再以此为模板扩增FOXA1的C端、N端cDNA片段，分别并克隆进带有GST标签的原核表达载体pGEX4T1，构建重组表达质粒.双酶切及测序鉴定正确后，转化至大肠杆菌BL21 Rosetta DE3，经IPTG诱导，Glutathione Sepharose 4B亲和纯化，通过SDSPAGE电泳及Western blot确定FOXA1蛋白的表达.与MCF7细胞裂解液孵育，进行GSTPull down试验，检测纯化蛋白与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功构建pGEX4T1FOXA1C和 pGEX4T1FOXA1N的原核表达载体；在大肠杆菌中诱导目的蛋白表达；经Glutathione Sepharose 4B纯化后，获得了人FOXA1的C端蛋白片段GSTFOXA1C与N端蛋白片段GSTFOXA1N；证实GSTFOXA1C能与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用. 　　关键词：转录因子FOXA1；原核表达；相互作用蛋白 　　中图分类号：Q786 文献标识码：A 　　转录因子FOXA1属于叉头框（Forkhead Box， Fox）转录因子家族的FOXA亚家族[1].FOX基因广泛地分布于从酵母到人的各种真核生物中，构成一个庞大的转录因子家族.其中在哺乳动物中就拥有40个以上成员，分别参与细胞分化、增殖、代谢及细胞凋亡等生理过程的调节[2]. FOXA1是该家族最早被克隆的成员[3]. 　　FOXA1蛋白介导许多蛋白的相互作用，调节发育、代谢和肿瘤的发生.FOXA1的功能区域由 DNA结合区和转录激活区构成.作为先锋转录因子，FOXA1的羧基端能与核心组蛋白H3，H4相互作用[4] 加强了FOXA1蛋白与核小体的结合能力.有研究表明转录因子FOXA1 羧基端的转录激活区可以招募TLE3/GRG3结合到染色质上[5].而FOXA1 DNA结合区可以干扰转录因子NKX2.1与DNA的结合功能从而抑制NKX2.1转录复合物的形成，抑制脑肺和甲状腺的发育[6].此外，FOXA1的DNA结合区还介导FOXA1与雄激素受体（AR）的相互作用[7]，而在乳腺癌细胞株中，雌激素的应答在一定程度上依赖于FOXA1的表达[8-9]. 　　为了进一步研究FOXA1在细胞中扮演的角色，本研究通过基因工程技术体外构建表达载体，诱导可溶性融合蛋白 GSTFOXA1C和GSTFOXA1N 的高效表达并亲和纯化.利用 GSTPull down技术，在乳腺癌细胞MCF7中证实GSTFOXA1C可与已知的FOXA1结合蛋白TLE3发生相互作用，证明纯化蛋白结构正确且能与其互作蛋白发生互作，为进一步寻找FOXA1的互作蛋白提供材料基础. 　　1材料与方法 　　1.1菌种、质粒、细胞系 　　大肠杆菌DH5α感受（北京鼎国），大肠杆菌BL21 Rosetta（DE3）感受态（广州百恩维），质粒pGEX4T1由本实验室保存，乳腺癌细胞MCF7为本实验室冻存. 　　1.2主要试剂 　　限制性内切酶BamHI，XhoI，T4 DNA连接酶均购自Fermentas公司，MMLV逆转录酶购于Promega公司，DNA高保真聚合酶购于TOYOBO公司，PCR 引物由上海生工生物公司合成，Glutathione Sepharose 4B购于GE，GST抗体购于碧云天，V5抗体购于Millpore公司. 　　1.3重组质粒pGEX4T1FOXA1N，pGEX4T1FOXA1C的构建及其鉴定 　　根据NCBI检索到的人源FOXA1的cDNA序列以及空载体PGEX4T1的多克隆位点确定FOXA1的上下游引物如表1所示.上游引物为CCC GGA TCC ATG TTA GGA ACT GTG AAG，下划线为BamH I 酶切位点，下游引物为CGC TCT AGA GGA AGT GTT TAG GAC GGG，下划线为EcoR I 酶切位点.以人的乳腺癌细胞MCF7提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为94 ℃ 2 min ；98 ℃ 10 s，68 ℃ 90 s，68 ℃ 10 min，32个循环.将 PCR产物克隆入pGEX4T1质粒中，双酶切鉴定后送上海生工测序.以测序正确的pGEX4T1FOXA1为模板，FOXA1C上游引物GCG CGA ATT CAA CCA CCC GTT CTC CAT CAA，FOXA1C下游引物GCG CC