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人溶菌酶基因在大肠杆菌中的表达研究 　　摘 要：为了研究一种高效表达有活性人溶菌酶的方法，将人溶菌酶基因克隆到质粒pBV220上，转化至大肠杆菌E.coliJM105中，筛选得到的阳性克隆，在SDS电泳显示有特异的蛋白条带出现，Western-blotting检测表明已经成功表达了人溶菌酶蛋白。通过本实验成功的构建了人溶菌酶的原核表达载体，并表达出了有活性的重组人溶菌酶，为人溶菌酶的产业化前景打下了基础。 　　关键词：人溶菌酶；表达；大肠杆菌 　　中图分类号：Q78 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20151232220 　　人溶菌酶（hLYZ）又称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解细菌细胞壁中粘多糖的 　　酶，能破坏粘多糖的β-1，4糖苷键，对革兰氏阳性菌细胞壁有直接破坏作用，从而达到杀菌的作用，在分泌型IgA和补体的参与下，对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用。因其具有无毒无副作用且无耐药性等特点，在医药领域越来越引起人们的重视，在临床治疗方面， 　　hLYZ具有消炎、消肿、组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用。hLYZ 　　还能与带负电荷的病毒蛋白直接作用，并能与DNA、RNA和脱辅基蛋白形成复盐而使病毒 　　失活[1]。关于hLYZ的抗肿瘤作用也有很多报道[2-3]。因此，hLYZ具有独特的药理作用和广 　　泛的临床应用价值。 　　l 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌种和质粒 　　E.coliJM105作为受体菌。质粒pBV220由由扬州大学生科院孙怀昌教授实验室提供[4]。含有人溶菌酶基因编码顺序的噬菌体Ml3mpl8-a1作为PCR扩增模板由本实验室构建[5]。 　　1.1.2 试剂和酶 　　实验所需各种限制酶均购自北京协和医科大学医学科技开发公司，T4DNA连接酶，Taq DNA聚合酶，Klenow大片段，4dNTP混台物购自美国Promega公司，其它试剂为国产分析纯试剂。 　　1.2 方法 　　1.2.1 受体菌的制备 　　质粒的提取分离、重组及转化按Sambrook等人的方法进行[6]。 　　1.2.2 多聚酶链反应（PCR） 　　噬菌体Ml3mpl8-a1作为PCR扩增模板；根据GenBank上已发表的人溶菌酶基因序列（AK311779）设计能特异性扩增人溶菌酶编码基因的引物序列。5’端引物P1：5’- AGGAATTCATGAAAGTTTTCGAACG-3’ ，（引物的5’端带有人工设计的EcoR I酶切位点GAATTC及保护性碱基AG）；3’端引物P2：5’- ATGCATGCTCATTAAACACCGC-3’ （引物的5’端带有保护性碱基TA）。在20μL PCR反应体系中含模板DNA660ng，引物Pl、P2各为1pmol/L，4dNTP 200μm/ L，10×TaqDNA聚合酶缓冲液2μL混匀，94℃，4min.加Taq DNA聚合酶lμL混匀，加石蜡油40μL，94℃，40s，45℃，40s，72℃，lmin，5个循环后改为94℃，40s，55℃，40s，72℃，1min，25个循环，最后一个循环72℃延长到10min.共30个循环。然后加lμL Klenow大片段，37℃，30min，70℃，10min，取2μLPCR反应物通过琼脂糖凝胶电泳后现察结果。PCR扩增产物经过酚、氯仿的萃取抽提，乙醇沉析后溶于TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCL pH8.0，0.1mmol/L EDTA）中备用。 　　1.2.3 PCR产物与pBV220基因重组、转化 　　pBV220质粒DNA经BamHI酶切后，用T4噬菌体聚合酶补平3’端，然后pBV220质粒DNA和上述PCR产物再分别经EcoR I酶切后在低熔点胶上回收，按1.5的比例在T4DNA连接酶的作用下，于14℃水浴内，约24h 进行重组连接，然后转化至大肠杆菌JM105中，37℃静止培养，16h后观察结果。 　　1.2.4 重组pBV220质粒在大肠杆菌中的表达及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）鉴定 　　含有pBV220质粒的E.coli过夜培养，按1∶50稀释转入LB培养液中，30℃，200rpm振荡培养至OD260为0.5～0.6后，42℃ 诱导4h，取1.5ml培养物中所得到的菌体悬浮液于50μL Laemmli缓冲液中[7]，100℃加热3min后离心（14000r/min，10min），取上清液35μL 在15%的SDS中进行电泳分析。 　　1.2.5 表达产物的免疫学鉴定 　　用Western Blotting来确证表达产物，表达产物用SDS分离后，在Bio-Rad电转移至PVDF膜上，免疫测试按Promega提