第八节分子克隆载体地选择.pptVIP

* * 第八节 分子克隆载体的选择 ? 1. 选择克隆载体的几个重要参数 1）实验对象 2）实验性质 3）载体容量 4）合适克隆位点 5）载体的稳定性 6）载体DNA制备的难易 7）外源基因表达产物产量、产物特点等 ? 2.?实验对象 1）供体：遗传背景与DNA特点等，其中包括染色体DNA大小，基因大小与结构，碱基组成，目的基因的产物特点以及遗传物质的传递方式等。 2）受体：各种中间宿主与终宿主的遗传背景，如遗传物质的传递方式(包括人为的方法)，DNA限制修饰系统，DNA重组基因特点，基因产物修饰系统，即转录与翻译后修饰系统。 常用于基因工程的宿主菌E.coli，菌株不同，基因型亦不同，不同载体要求不同菌株。如： E.coli DH5: F–, endA1, hsdR17(rk–,mk+ ),supE44,thi–,λ–,recA1, relA1,gyrA96 E.coli DH5α: F–, endA1, hsdR17(rk–,mk+ ),supE44,thi–,λ–, recA1, relA1,gyrA96; φ80dlacZ△M15, △(lacZYA-argF)U169 E .coliDH5αF’: F’, endA1, hsdR17(rk–,mk+ ),supE44,thi–, λ–, recA1, relA1, gyrA96,φ80dlacZ△M15, △(lacZYA-argF)U169 i.?三者均有限制-修饰系统和重组基因缺陷，外源DNA可存活，且不发生重组 ii.?DH5α和 DH5αF’都具有一个可供遗传标记lacZα检测的遗传背景 iii.?DH5αF’可供M13mp系列载体配套使用，M13病毒的感染需要 F’的存在 3. 实验性质 分子克隆的一般程序包括以下几步： i. 分离供体DNA或RNA（mRNA）和载体DNA ⅱ.构建基因文库或cDNA文库 ⅲ.目的基因或cDNA 克隆的筛选 ⅳ.目的基因或cDNA片段的鉴定：限制酶谱，次克隆，核苷酸序列分析，基因结构分析等 ⅴ.基因表达与调控机理的研究 1) 建立文库用载体 常在E.coli进行 i.目的基因与供体基因大小 小—质粒载体，操作方便，鉴定简单 大—λ或cos质粒载体, 甚至P1或pYAC载体(为减少文库规模，即使基因组小的也可用λ和cos载体） ii.筛选方法 ⅰ)互补法：可表达,选一般载体;不表达，选表达载体(外源基因必须表达，表达产物必须具备活性) ⅱ)免疫法：与上同，但表达产物不一定具生物活性 ⅲ)杂交法：各种载体均可 2) 目的基因的鉴定 次克隆：选用质粒载体，限制酶谱分析，基因结构分析等 定序：定序载体（M13mp系列），其他质粒载体（如pUC系列，pBR322，T3，T7，SP6启动子载体） 3) 基因表达与调控 外源基因可表达—普通载体; 不表达—表达型（分泌）载体 4.?载体容量 M13mp载体 4 kb 细菌质粒载体 10kb λ载体 23kb cos质粒载体 48kb P1载体 95 kb pYAC载体 ∽1000 kb 5.?合适的克隆位点 单克隆位点和多克隆位点 第 九 节 分子克隆载体的组建 ? 构建克隆载体必须考虑的条件：复制起点，克隆位点，标记基因，载体容量等。 ? 1.?克隆位点的建立 1)??体外重组 i.?? 减少限制酶识别位点 ii.? 增加限制酶识别位点： 人工接头，匹配接头 2)?体内重组或突变 i.? 减少限制酶识别位点 体内自发突变和体外限制酶切富集。如在构建pSUPV系列载体时，去除Kanr 基因中的HindIII位点就采用了以下技术路线： 培养有pNG35的大肠杆菌细胞 提取质粒DNA 用HindIII ? 完全酶切 转化大肠杆菌 再提取质粒DNA 再酶切， 再转化，直至提取单菌落质粒DNA已无法用HindIII酶切为止 ii.??增加限制酶识别位点 M13mp系列