精品亲和层析的运用.pptVIP

* 亲和层析在生产生活中的应用 引言 亲和层析(affinity chromatography)是利用偶联亲和配体的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物。它具有很高的选择和分离性能以及较大的载量，只需要一步处理即可使某待分离的生物大分子从复杂的混合物中分离出来，达到千倍以上的纯化，并保持较高的活性，是分离纯化以及分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具。 最近几十年来．亲和层析技术发展十分迅速，广泛应用于生物分子(如结合蛋白、酶、抑制荆、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等)及组织(如细胞、细胞器、病毒等)的分离和纯化，是蛋白质组学研究中重要的技术之一． 优点： 1.纯化过程简单、迅速 2.分离效率高 3.实验条件温和 缺点： 1.亲和吸附剂通用性较差。针对某一分离对象就需要制备专一的吸附剂和建立相应的实验条件 2.配体的选择及其与基质的共价结合需 要烦琐的操作步骤 亲和层析基本原理 基本原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。 含配体溶液 收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白 混合蛋白样品 平衡液 带有配体的树脂珠（或胶粒） Chitin 几丁质 CHOM 鸡蛋粘多糖蛋白 Trypsin 胰岛素 亲和层析的应用 核酸的纯化 因为DNA与RNA之间具有专一性的亲和力，所以亲和层析可应用于核酸的研究，例如从大肠杆菌的RNA混合物中分离出专一于噬菌体T4 的RNA，可将T4的DNA以共价键结方式接于cellulose材质的管柱中，再将所要的RNA分离出。 此外，根据核酸与蛋白质之间交互作用的原理，可以将单股DNA接在Sepharose上，纯化DNA聚合酶或RNA聚合酶。 激素受体的纯化 激素受体是细胞膜上与特定激素结合的成份，激素和受体的作用具有特异性，目前用亲和层析法已经能够将激素与sephrose的组合，纯化胰岛素、正甲状腺素的受体。 抗体与抗原的纯化 抗体与抗原结合具有高度专一性，Sepharose是这一类亲和层析较佳的载体，由于抗原-抗体复合物的解离常数很低，因此抗原在固定化抗体上被吸附后，要尽快将它洗出，冲洗液的条件通常是控制pH值至3以下，成份为醋酸、盐酸、Tris-HCl缓冲液、20% 甲酸或1mol/L 丙酸，也有使用尿素这一类的蛋白质变性剂作为洗出用的溶液。 酶和酶的抑制剂纯化 使用亲和层析法纯化酶，可以得到相当好的效果。例如，要分离猪和牛的胰蛋白酶，可以连接鸡卵黏蛋白（胰蛋白酶的抑制剂）与Sepharose 4B当作层析柱材质，用它纯化出来的胰蛋白酶相当于5次再结晶的纯度。 除了使用抑制剂当配体，也可以反过来用酶作为配体来纯化抑制剂，例如，将胰蛋白酶接到Sepharose上，能有效分离纯化大肠杆菌中的胰蛋白抑制剂Ecotin。 亲和层析法分离胆固醇氧化酶 季文明,陈毅力等 江南大学生物工程学院 亲和层析法分离胆固醇氧化酶 胆固醇氧化酶是一种多功能酶。目前,医院应用胆固醇氧化酶检测血清胆固醇含量。胆固醇氧化酶可以降低食品中的胆固醇含量；能有效抑制鳞翅目昆虫的生长繁殖,是一种生物杀虫剂；胆固醇的氧化产物胆甾-4-烯-3-酮还具有抗肥胖、治疗肝病等药效。 亲和层析法分离胆固醇氧化酶 发酵产物经过盐析操作以后，得到层析用样品。 他们利用一种脂溶性凝胶SepherdexLH20作为胆固醇的载体,其分离的分子量小于3000。胆固醇也为脂溶性的化合物,与凝胶LH20有很好的相容性,而酶蛋白不能进入凝胶。 亲和层析法分离胆固醇氧化酶 他们每次进行实验时加入1~5ml的样品,用1~5倍体积的缓冲液A洗去杂物,流速为0.5~2ml/min；然后再用缓冲液B洗脱酶蛋白,流速为015~2ml/min。 亲和层析法分离胆固醇氧化酶 他们对表面活性剂的浓度和洗脱速度的条件进行了考察，得到用亲和层析分离纯化胆固醇氧化酶,酶比活从0.45U/mg提高到15.5U/mg。亲和层析的适合条件为洗脱液A的流速是015ml/min,洗脱液B的流速是210ml/min。 实验室内可用此法分离纯化胆固醇氧化酶,但是从实际操作和经济角度考虑，该法不适合大规模处理。 结论 在发现和生产治疗疾病的蛋白方面的挑战已经使人们有必要重新考虑设计和进行纯化的过程，这种选择主要是由方法的引进速度,有效性,稳定性和经济承受能力决定的.传统的纯化规程正被高度选择性和成熟的以亲和层析为基础的策略所代替． 这种技术对于纯化提供一种理性的设计并刺激和探索选择性纯化目标蛋白的分子识别的自然生物过程,亲和层析可能是现行仅