第七次课-PAS染色显示细胞中多糖成分.ppt

糖原的显色——PAS反应（periodic acid schiff reaction） 一、制片技术 生物体的组织细胞大部分都是不透明的，不能直接在显微镜下观察，需要切成薄片，必须采用各种特殊的方法对材料进行处理，把材料制成薄片标本，经过染色后，置于显微镜下观察它们的微细结构。 石蜡切片 石蜡切片法是组织学常规制片技术中应用最广泛的一种方法，是以石蜡作包埋剂，用旋转切片机将标本切成薄片，经一系列处理制成永久切片。 制作过程：1.取材→2.固定→3.洗涤→4.脱水→5.透明→6.浸蜡→7.包埋→8.切片→9.贴片→10.脱蜡复水→11.染色→12.脱水→13.透明→14.封片。 1.取材 从人或动物体内取下所需组织或器官，材料必须新鲜，组织块不宜太大，以便固定剂穿透。 2. 固定 目的：迅速凝固蛋白质，终止细胞一切代谢过程，防止组织自溶，保持其活体时结构。 固定剂：10%甲醛、80%酒精、混合固定剂（Bouin氏液、FAA液、Carnoy氏液）。 用量：必须充足，一般为材料块的20~30倍。 固定时间：数小时至24小时。 3. 洗涤 目的：除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，以免影响后面的染色效果。 方法：多数用流水冲洗，少数用酒精。 4.脱水 目的：固定或洗涤后的组织内充满水分，而水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去，才能进行石蜡包埋。 脱水剂：酒精 方法：从低浓度到高浓度梯度酒精脱水：30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%各级酒精中放置1～数小时。 水 酒精 石蜡 5.透明 目的：酒精与石蜡不相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。组织在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，因此该过程称透明。 透明剂：二甲苯。 方法：酒精二甲苯等量混合液（1：1）15分钟，二甲苯30分钟。 水→酒精→二甲苯→石蜡 6.浸蜡 目的：除去组织中的透明剂，使石蜡渗透到组织内部，达到饱和程度以便包埋。 方法：石蜡二甲苯等量混合15分钟，石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ 各30分钟。浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内（石蜡的熔点在50~60℃之间）。 7.包埋 目的：将浸蜡后的组织块包埋于石蜡中。 方法：取出组织块，置于盛有融化石蜡的包埋框中，迅速放入冷水中冷却，待石蜡完全凝固（约30min）后取出，即做成含有组织块的蜡块标本。 8.切片  将蜡块装在切片机上，调整所需的切片厚度（4~10um），进行切片，切出一片接一片的蜡带，用刀片割开蜡带。 9.贴片  目的：借助粘附剂将展平的蜡片粘附于载玻片上，以免在以后的操作步骤中脱落。 方法：在洁净的载玻片上涂抹薄层粘附剂（如多聚赖氨酸），滴两滴蒸馏水于载玻片上，把蜡片放于水滴上，略加温使蜡片铺展，将载玻片放入温箱中干燥。 10.脱蜡复水 目的：染色液多数为水溶液，因此染色前必须将组织中的蜡脱去，才能进行染色。 方法：与脱水浸蜡过程正好相反： 二甲苯Ⅰ、Ⅱ30min→100%酒精→90%酒精→80%酒精→70%酒精→蒸馏水 各2min。 石蜡→二甲苯→酒精→水 11.染色 目的：使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。 经典的HE染色法： 苏木精（Hematoxylin） 伊红（Eosin） ↓ ↓ 碱性染料 酸性染料 ↓ ↓ 细胞核中的DNA、RNA等 细胞质、膜性结构等 嗜碱性物质（本身酸性） 嗜酸性物质（本身碱性） ↓ ↓ 染成蓝色 染成红色 12.脱水 13.透明 14. 封片 目的：去除水分，透明组织，便于观察和长期保存标本。 方法： 脱水：95%酒精 2分钟→100%酒精 2分钟 透明：二甲苯I 2分钟→二甲苯II 2分钟 封片：将载玻片从二甲苯中取出放在吸水纸，迅速地在切片的中间滴一滴中性树胶，