抗速灭威噬菌体单链抗体库的构建筛选及鉴定.docVIP

抗速灭威噬菌体单链抗体库的构建筛选及鉴定 　　摘要：以速灭威抗原免疫的小鼠为实验对象，取其脾细胞，ＲＴ－ＰＣＲ扩增抗体重链可变区（ＶＨ）和轻链可变区（ＶＬ）基因，重叠延伸ＰＣＲ拼接单链抗体（ＳｃＦｖ）基因，克隆入噬菌粒表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ并转化大肠杆菌ＴＧ１，成功构建了库容约７．６×１０５的抗速灭威噬菌体ScFv库。对该文库进行了５轮“吸附-洗脱-扩增”的富集筛选，获得了６个特异性较强的抗速灭威噬菌体ＳｃＦｖ阳性克隆。其研究结果为速灭威特异性抗体的大量制备奠定了一定的基础。 　　关键词：速灭威；单链抗体；噬菌体展示 　　中图分类号：Ｑ８１９ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）09－1908-05 　　 　　Construction，Screening and Identification of Phage ScFv Library Against Metolcarb 　　 　　ＬＩ Ｔｉｅ－ｊｕｎ１，ＬＩ Ｄｅ－ｑｕａｎ２ 　　（１． Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎａｎｔｏｎｇ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｎａｎｔｏｎｇ ２２６００７，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ； 　　２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｎａｎｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｔｏｎｇ ２２６００７，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ） 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｂａｌｂ／Ｃ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｈａｐｔｅｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｏｆ Ｍｅｔｏｌｃａｒｂ， ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｐｌｅｅｎ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ． ＶＨ ａｎｄ ＶＬ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ． ＶＨ ａｎｄ ＶＬ ｗｅｒｅ matched into ScFc by overlap extension PCR， ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍed ＴＧ１ ｃｅｌｌｓ． Ｔｈｕｓ ｔｈｅ ｐｈａｇｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ（ＳｃＦｖ） ｌｉｂｒａｒｙ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｚｅ ｏｆ ａｂｏｕｔ ７．６×１０５ was ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｗａｓ ｂｉｏｐａｎｎｅｄ ｂｙ ５ ｒｏｕｎｄｓ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ－ｅｌｕｔｉｏｎ－ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ； ａｎｄ ６ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｔｏｌｃａｒｂ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｍｅｔｏｌｃａｒｂ． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｅｔｏｌｃａｒｂ；ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ（SｃＦｖ）； ｐｈａｇｅ－ｄｉｓｐｌａｙ 　　速灭威（Ｍｅｔｏｌｃａｒｂ，３－甲苯基－Ｎ－甲基氨基甲酸酯）是氨基甲酸酯类杀虫剂，具有触杀和熏蒸作用，主要用于稻田、蔬菜、水果及经济作物等的害虫防治。虽然速灭威为中等毒杀虫剂，但农产品上残留的速灭威仍会对人体健康造成潜在的危害，有必要对其进行持续的监控检测［１］。 　　目前定量分析速灭威残留的主要方法是气相色谱（ＧＣ）和高效液相色谱（ＨＰＬＣ）等仪器分析法，但这些方法必须对样品进行步骤冗长的纯化处理，很难达到快速、简便的现场检测要求；与仪器分析相比，免疫分析法具有快速、简单、灵敏、价廉等优点，可用于现场快速检测，具有广阔的应用前景和开发潜力［２］。 　　抗体作为免疫分析的核心试剂，其制备技术一直是制约免疫分析法在农药残留分析领域应用的瓶颈因素。与传统的多抗和单抗制备技术相比，第三代抗体制备技术――噬菌体抗体库技术具有基因型与表型相统一、选择与扩增相统一的优点，它不仅可以绕过繁琐的杂交瘤制备过程，甚至可以省略动物免疫的步骤，使得建立各种文库以及体外筛选任何目的分子的重组抗体成为可能［３］。因此，噬菌体抗体库技术为化学农药抗体的制备开拓了新的思路。 　　本研究利用噬菌体展示技术，构建抗速灭威噬菌体ＳｃＦｖ库，从中筛选与速灭威特异性结合的噬菌体ＳｃＦｖ阳性克隆，为进一步实现速灭威免疫快速检测提供大量制备特异性抗体的新途径。目前，国内外有关速灭威ＳｃＦｖ制备的研究尚未见报道。 　　１材料与方法