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兔出血症病毒感染机体后炎性因子检测分析 　　摘要：兔出血症病毒（RHDV）感染成年兔可以诱导兔体内产生强烈的炎性反应，是病毒感染后急性死亡的重要原因之一。为揭示病毒感染机体后体内重要炎性因子的表达情况，采用荧光定量PCR方法检测RHDV感染后6、12、24、30、36 h兔外周血、肝脏和脾脏内病毒增殖情况以及IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ炎性因子的表达情况。结果表明，兔出血症病毒拷贝数在外周血、肝脏和脾脏内随着感染时间的变化呈快速上升的趋势。外周血、肝脏和脾脏在病毒感染中，促炎性因子IL-6和TNF-α表达水平都明显上调。肝脏促炎性因子IL-6在30 h左右达到最大值，而在外周血和脾脏中则持续上调。抑炎因子IL-10随着炎性因子的上调也随之上升，但其表达水平只有较低程度的上调。IFN-γ相对表达水平在肝脏和脾脏有短暂的上调，在外周血中则持续下调。 　　关键词：兔出血症病毒；炎性因子；荧光定量PCR；外周血；脾脏；肝脏 　　中图分类号： S852.65；S858.291文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0238-03 　　收稿日期：2016-01-20 　　基金项目：现代农业产业技术体系建设兔体系病毒病预防与控制岗位专项（编号：CARS-44-C-1）；公益性行业（农业）科研专项（编号：201303046）；江苏省自然科学基金（编号：B。 　　作者简介：仇汝龙（1988―），男，山东济宁人，硕士研究生，助理研究员，主要从事家兔疾病防治与兽医生物技术研究。E-mail：qrl8891@163.com。 　　通信作者：王芳，博士，研究员，主要从事家兔重要疫病致病机制及防控技术的研究。E-mail：rwangfang@126.com。 　　兔出血症（RHD）是对野兔和家兔具有高度传染性的疾病，其病原是兔出血症病毒（RHDV），属于杯状病毒家族的兔病毒属[1]。感染兔出血症病毒的成年兔在48～72 h内死亡[2]，死亡原因主要为肝脏快速衰竭并伴随强烈的炎症反应。在免疫反应中，调节炎症反应的正是信号通路及细胞因子。 　　细胞因子是调节性蛋白，在调节免疫反应中的细胞反应阶段有着重要的作用，包括淋巴细胞的激活、增殖、分化、存活和凋亡[3]。它们是低分子量蛋白，主要是由淋巴细胞、抗原呈递细胞、单核细胞、内皮细胞和纤维细胞等分泌。细胞因子可分为不同的类别，比如白介素、干扰素、肿瘤坏死因子和趋化因子等。细胞因子相互作用，施展极化效应于T细胞并且调整免疫反应[4]。CD4+亚群（Th细胞）根据自身所分泌的细胞因子，分为Th1和Th2亚群。Th1细胞分泌IFN-γ、淋巴毒素和IL-2，可以刺激炎症反应，比如迟发型超敏反应，促进补体的产生和细胞毒性T细胞分化。Th2细胞分泌IL-4、IL-5和IL-10等，调节体液免疫反应[5-6]。多数研究证明宿主感染的程度以Th1和Th2细胞为基础[7]。IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ和TNF-α等[8-11]兔细胞因子序列的发表，促使检测兔细胞因子的分子生物学试验的产生。荧光定量PCR具有敏感性和结果快速性，可以作为检测细胞因子的方法。本研究通过荧光定量的方法，检测感染RHDV兔体内病毒拷贝数和炎性因子的变化，为研究兔出血症病毒的感染及致病机制奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1病毒和试验兔 　　兔出血症病毒（由江苏省农业科学院兽医研究所保存）；新西兰成年白兔40只，购自南京金陵种兔场。 　　1.2主要试剂和仪器 　　Trizol RNAiso plus，反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）和荧光定量试剂SYBR Premix EX Taq，均购自Takara公司。pMD18-T Vector和大肠杆菌DH5α均购自南京基天生物公司，荧光定量机器Stepone 7300，人外周血淋巴细胞分离液，购自天津市灏洋生物制品有限责任公司。 　　1.3引物 　　炎性因子IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的检测引物[12]见表1，VP60模板引物及VP60检测引物建立标准曲线和检测样品[13]。引物由Invitrogen公司合成。 　　1.4试验动物分组和取样 　　将40只新西兰兔分为5组，每组5只攻毒兔和3只对照兔，兔攻毒采用颈部皮下注射0.5 mL HA为28 RHDV的肝悬液。5组兔分别在攻毒后6、12、24、30、36 h取样后杀死。血液通过心脏采血，采集后立即分离淋巴细胞和血清，肝脏和脾脏则保存于-70 ℃备用。 　　1.5RNA的提取及反转录 　　1.5.1炎