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第二十章 第一节 自然界的基因重组 一、转化作用 二、转导作用 三、转位（转座） 二、Transduction转导作用 三、基因重排 四、（转位）转座 第二节 基因克隆的工具酶 限制性核酸内切酶的切割频率 DNA分子中核苷酸序列是随机排列的，一个识别四个核苷酸序列的内切酶平均每隔256bp（44）出现一次该酶的识别切割位点。 那么，识别6或8核苷酸序列的内切酶的切割频率是多少？ 第三节 基因克隆的载体 理想载体应具备的几个条件 能在宿主细胞内携带目的基因复制扩增 ，具有较高拷贝数。 有多个限制性内切酶单一位点 ，便于外源基因的插入。 有易检测的遗传筛选标记，如抗生素抗性基因，用于阳性克隆的筛选。 分子量小，允许插入外源基因的容量较大。 载体分类（按功能分） 克隆载体：用于外源DNA的克隆和扩增。 表达载体：用于外源基因的表达（转录翻译生成蛋白质） 一、克隆载体 质粒载体 噬菌体载体 病毒载体 真核表达载体 真核表达载体 第四节 基因克隆的一般过程 基因克隆的基本过程 1．? 载体的选择和制备 2．? 制备目的基因片段 3．? 目的基因和载体间的重组连接 4．? 重组DNA导入受体细胞 5．?重组子的筛选和鉴定? 6．? 重组子的扩增或表达 一、目的基因的获取 2.用RT-PCR（逆转录-PCR）获得基因 以mRNA为模板，先进行逆转录得到cDNA（complementary DNA，cDNA），再进行的PCR反应 3.从基因组文库或cDNA文库中获取基因 基因组文库（genomic DNA library） 含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体 cDNA文库（cDNA library） 含有某一组织细胞中的全部mRNA信息 文库构建 提取染色体DNA ↓ DNA片段 ↓ 插入适当的克隆载体 ↓ 转入受体菌扩增 ↓ 基因组文库 细胞总mRNA ↓反转录酶 cDNA ↓ 插入合适载体 ↓ 转入受体菌 ↓ cDNA文库 4．人工合成基因 二、克隆载体的选择与制备 三、目的基因与克隆载体的连接 （一）粘性末端连接 1.利用相同的酶切位点——单酶单切点 用同一种酶分别切割目的基因/载体，然后进行连接。 优点：二者产生相同的粘性末端，彼此很易按碱基配对退火，在ligase作用下生成DNA分子重组体。 如：gene EcoRⅠ vector EcoR Ⅰ 问题与解决办法： （1）自身环化 粘性末端自发形成双链，连接产物含大量的目的基因和载体自身环化的假重组体－若转化则出现假阳性克隆。 解决办法是 用高浓度的DNA（目的基因：载体为3：1）和碱性磷酸酶（AP：BIP/CIP）处理载体，去除5’－P使之不能自身环化，缺口在宿主内可得到修复。 （2）不能定向克隆/插入 由于是单一位点，目的基因可以以不同方向插入载体。对于克隆扩增问题不大，因为克隆上去的基因再重组时又要切下来；对于表达载体目的基因必须按5‘－3’方向克隆在启动子下游而不能反之。 2.利用相同的酶切位点——双酶双切点（定向克隆） 优点（1）避免载体/目的基因的自身环化，提高连接效率；（2）可控制外源基因插入方向。 构建表达载体时最好使用双酶双切点，这样方式也称定向克隆。如：目的基因和载体都有EcoRⅠ，PstⅠ酶切位点，产生各自互补粘端，分别配对连接。 3.通过同聚物加尾连接 同聚物加尾是指用末端脱氧核苷酸转移酶将某种脱氧核苷酸加到目的基因的3’末端的羟基上（poly dC)，又将与之互补的脱氧核苷酸（poly dG)加到载体3’末端的羟基上，制造出粘性末端。 dC：dG同源多聚尾是连接DNA片段克隆cDNA的有效方法。 6. T载体（A /T克隆法） 在克隆PCR产物cDNA时可采用这一方法。 （1）cDNA末端添加AA 利用Taq pol延伸活性，以不依赖模板的方式在已完成延伸的PCR产物的3’端添加AA（利用DNA pol活性可成）。 （2）末端为TT的线性化的T载体可用下述2种方法得到： ①MbcⅡ、XcmⅠ或HphⅠ酶切产生单个T突出末端； ②将T加到酶切产生的平端的载体上； T载体已商品化。 （二）平头末端的连接 四、重组DNA（rDNA）导入受体细胞 （一）序言 1. 导入目的 （1）克隆扩增 rDNA导入宿主细胞，利用宿主的生理条件，克隆扩增，克隆片段随着载体（如质粒）一起扩增获得扩增DNA片段（如细菌分裂繁殖）。 （2）克隆表达 利用宿主的生理条件，生产基因工程产品