实验二质粒DN的酶切鉴定.pptVIP

实验二 质粒DNA的酶切鉴定 【目的要求】 1．了解一般限制性内切酶的特性； 2．学习设计酶切方案的一般规律,载体与供体进行酶切 ； 3．掌握酶的保存与使用方法； 【实验原理】 限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，共有I型、、II型、III型三类， II型限制性内切酶识别含4－8个核苷酸且具有回文对称性质的核酸序列，并在识别序列内或侧旁特异性位点切开DNA双链，产生平齐末端和带单链突出端（粘性末端）的DNA片断，常用于基因克隆的载体切割、外源DNA的制备。在分子克隆中I、III类型限制性内切酶都不常用。 【实验器材】 台式离心机、振荡器，恒温水浴，微量移液器（20uL, 200 uL 1000uL）,1.5mL Enpendorf管 【实验材料】 限制性内切酶及酶切缓冲液、无菌水， 【实验内容】 1．酶切有关基础知识介绍： 2．小量酶切，电泳鉴定 3. 酶切体系的建立： 表3. .质粒酶切反应体系的建立 影响限制性内切酶的因素很多，酶反应条件是实验成功的重要因素，其中包括反应的温度、时间与反应的缓冲体系、DNA的纯度和浓度等。 酶切反应体系的组成：DNA量→酶量（最多占总体积的1/10）→总体积，即根据所用DNA的量确定用酶量，再根据用的酶量确