冬凌草甲素对NCIH460肺癌细胞凋亡相关蛋白影响.docVIP

冬凌草甲素对NCIH460肺癌细胞凋亡相关蛋白影响 　　 肺癌在我国已经成为癌症死亡的首要病因。冬凌草甲素是从冬凌草中提取出来的天然化合物，其分子式为C12H28O6，具有抗肿瘤活性，能诱导多种肿瘤细胞凋亡[1]。本文旨在探讨冬凌草甲素促进肺癌细胞凋亡的作用机制，为肺癌的治疗提供理论依据。 　　1资料 　　肺癌细胞株NCI-H460细胞购自中国科学院细胞研究所。冬凌草甲素（纯度≥98%）购自上海诗丹德生物技术有限公司。RPMI 1640购自Gibco公司；噻唑蓝（Thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）及二甲基亚砜购自Sigma公司；兔抗鼠IgG抗体及鼠抗人β-actin、livin、survivin抗体购自Santa Cruz公司；Western-blot Luminol(ECL)试剂盒购自Santa Cruz公司。 　　2方法 　　2.1细胞培养NCI-H460肺癌细胞接种于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，于37℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养。取对数生长期的细胞进行实验，分为对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组，分布加入冬凌草甲素使终浓度为0、8、16、24μmol/L。 　　2.2凋亡细胞的形态学观察采用Hoechst33342/PI荧光双重染色。培养细胞中加入Hoechst33342，终浓度为5μg/ml，37℃避光染色10min，加入PI染液，终浓度为15μg/ml，4℃避光反应10min，荧光显微镜下观察。 　　2.3流式细胞仪检测细胞凋亡收集1×105个细胞，用冷PBS洗涤细胞两次，细胞重悬后Hoechst33342/PI染色，1h内用流式细胞仪检测凋亡。其中活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡细胞有较强的绿色荧光，坏死细胞有绿色和红色荧光双重染色。 　　2.4 Western blot检测livin、survivin表达收集4组细胞，将每组细胞1×106个裂解，提取蛋白,测定蛋白浓度；用SDS凝胶电泳，将蛋白电转移至硝酸纤维素膜，室温封闭1h，加入鼠抗人β-actin、livin、survivin抗体，再加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG抗体，进行ECL反应显影并曝光，用Quality One软件分析条带相对吸光度值（靶蛋白吸光度/β-actin吸光度），比较蛋白表达水平。 　　2.5 统计学处理实验数据以均数±标准差（x±s）表示，用SPSS 17.0软件进行数据的统计分析。多组资料间的比较用方差分析，检验水准α=0.05。 　　3结果 　　3.1凋亡细胞的形态学变化荧光显微镜下观察，对照组仅有很低的荧光强度，实验组出现有较强绿色荧光的凋亡细胞和有红绿双重荧光的坏死细胞。凋亡细胞变圆或皱缩，细胞膜完整，部分细胞核内染色质浓缩成块状、分叶状或形成粗细不均匀的碎块并相互分离，不均匀地分散于细胞质中，胞质中出现空泡，形成凋亡小体。说明冬凌草甲素具有促进NCI-H460细胞凋亡的作用。 　　3.2细胞凋亡率检测冬凌草甲素作用24h、48h、72h时，实验组细胞凋亡率均高于对照组（P0.05），表明冬凌草甲素能有效诱导NCI-H460细胞凋亡，低浓度组、中浓度组和高浓度组之间凋亡率有显著性差异，随冬凌草甲素浓度的增大，细胞凋亡率也相应升高，表明冬凌草甲素诱导NCI-H460细胞凋亡的作用具有剂量依赖性（图1）。 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　图1 细胞凋亡率测定 　　3.3 Western blot检测livin、survivin表达4组均有survivin和livin的不同程度的表达，以靶蛋白吸光度/β-actin吸光度的比值代表蛋白相对表达水平，实验组survivin和livin的表达均低于对照组（P0.01）。随着冬凌草甲素浓度的升高，livin与survivin的表达逐渐降低，高浓度组表达survivin及livin水平最低（表1）。表明冬凌草甲素能抑制NCI-H460细胞中survivin和livin蛋白表达，其抑制作用与冬凌草甲素浓度相关。 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　4 讨论 　　寻找有效的抗肿瘤药物对于肺癌的治疗具有极其重要的意义。冬凌草甲素是从冬凌草中提取出来的二萜类化合物，其分子式为C12H28O6，具有明显的抗肿瘤活性，能够抑制肝癌、胃癌、食管癌、黑色素瘤等多种肿瘤细胞的增殖，抑制核转录因子-KB（NF-KB）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）[2]、表皮生长因子受体等相关信号通路，诱导肿瘤细胞的凋亡[3]。目前已有冬凌草甲素对肺癌细胞作用的报道，研究显示冬凌草甲素能诱导A549细胞和SP