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黄泽颖 第 PAGE 18 页 DATE \@ yyyy-M-d 2007-3-14 专题1 基因工程 1.1 DNA重组技术的基本工具 一、 教学目标 1.知识方面 简述DNA重组技术所需三种基本工具的作用。 2.情感态度与价值观方面 认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 二、 教学重点和难点 1.教学重点 DNA重组技术所需的三种基本工具的作用。 2.教学难点 基因工程载体需要具备的条件。 三、教学方法 讲授法，对话法 四、教学课时 2 五、教学过程 基因工程的概念：“基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。” 一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” ⑴来源 ⑵作用 〖问题〗1.什么叫磷酸二酯键？ 〖生思考讨论回答，师提示〗3,5磷酸二酯键是核酸中核苷酸的连接方式，组成了核酸的一级结构。在核酸中一个核苷酸核糖上第3位的羟基与下一个核苷酸核糖上第5位的磷酸羟基脱水缩合成酯键，该酯键称3,5磷酸二酯键。若干个核苷酸间以3′,5′磷酸二酯键（如下图）连接成的多核苷酸链为核酸。在链的一端的一个核苷酸，其核糖上第5位连接的磷酸只有一个酯键，称此核苷酸为DNA链的5′磷酸末端或5′端。另一端核苷酸上第3位的羟基是自由的，所以此核苷酸称为3′羟基末端或3′端。链内的核苷酸第5位上的磷酸已形成二酯键，第3位上的羟基也已参与二酯键的形成，故称核苷酸残基。 图 DNA上的磷酸二酯键 〖寻根问底1〗2.根据你所掌握的知识，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？ 〖生思考讨论回答，师提示〗：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 〖问题〗3.联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 〖生思考讨论回答，师提示〗迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。 ⑶结果 ①黏性末端 ②平末端 〖问题〗4.限制酶所识别的序列有什么特点？ 〖生思考讨论回答，师提示〗限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到 一条中心轴线（如右图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。 〖思考与探究〗1.限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段： (1) …CTGCA??? (2) …AC??? (3) GC… （4） …G????? (5)????G…? (6) …GC ??? …G??????????? …TG??????? CG… …CTTAA???? ACGTC…????? …CG (7) GT…???????(8)AATTC… ????CA…????????????? G… 你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？ 〖生思考讨论回答，师提示〗答： 任何一种限制酶都只识别和切断特定的核苷酸序列，这是由限制酶的性质所决定的。 2和7能连接形成…ACGT… 4和8能连接形成…GAATTC… ???????????? ?…TGCA…； …CTTAAG…； 3和6能连接形成…GCGC… 1和5能连接形成…CTGCAG… ???????????? …CGCG…； …GACGTC…。 二、DNA连接酶——“分子缝合针” ㈠分类 连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。 ㈡作用 这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口（nick），而不能连接单链DNA。 〖问题〗6.DNA连接酶连接的是什么部位？ 〖生思考讨论回答，师提示〗DNA连接酶是将一段DNA片段3′端的羟基与另一DNA片段5′端磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键，