重组DNA的技术.pptVIP

1、具备复制能力。 2、具备一个或多个筛选标志。 3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。 4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多克隆位 点，MCS）。 5、具有较高的遗传稳定性。 1、质粒（plasmid）: 质粒为细菌染色体之外一些能独立复制并保持稳定遗传的复制子。结构上，它是一种双链闭合环状的DNA分子。 是感染细菌的一类病毒，寄生于细菌中，并能溶解细菌细胞，故称噬菌体。 4、病毒 (5)直接用限制性内切酶切取、分离： 对一些物理图谱已经确定，背景资料清楚的原核生物、噬菌体及病毒等基因组，可直接用限制性内切酶消化后，通过分离获得目的基因。 平端 DNA片段可以在T4 DNA连接酶的作用 下相连接，但连接效率较低。为提高连接效率, 所用的ATP及T4 DNA连接酶的浓度比粘性末端 连接要高些。 （4）同聚物加尾连接： （5）人工接头连接： 4、重组DNA导入受菌体 5、重组体的筛选与鉴定 筛选是指通过某些特定方法，从被转化的细 胞群体或基因文库中，鉴别出真正的阳性重组子 的过程。 6、外源基因的表达与分离纯化 （2）构建基因组DNA文库： 将某种生物细胞的整个基 因组DNA用物理或酶学的方法 切割成预期大小的片断，并将 所有这些片断都与适当的载体 连接，引入相应的宿主细胞中 保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体 上带有了该生物体的全部基 因，称为基因文库。 (3)构建cDNA文库： (4)聚合酶链反应（PCR） 已知目的基因的基因序列，用PCR从基因组DNA中获得目的基因，或用逆转录PCR方法直接从mRNA获得特定基因的cDNA。 2、克隆载体的选择和构建 用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的λ噬菌体和黏性质粒； cDNA文库和克隆较小DNA片段通常选pUC系列质粒； 待测DNA序列使用M13噬菌体。 由同一种限制酶切割或不同的限制酶切割形成互补的黏性末端。经退火后，由DNA连接酶连接。 3、目的基因与载体的连接 ⑴粘性末端连接： （2）平端连接： （3）定向连接： Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 重组体 接头是指含有某些限制性内切酶切点的寡核苷酸片段。 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ 将重组DNA或其他外源DNA导入宿主细胞的常用方法： 转化、感染、转染、显微注射、电穿孔等。 转化（transformation）：是指将重组质粒DNA导入受体细胞。 转染（transfection）：将重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程。 转导（transduction）：重组噬菌体DNA分子，在体外经过包 装成具有感染能力的噬菌体颗粒，再以此噬菌体为载体，将 重组DNA导入受体细胞内的过程，也称为感染（infection）。 （一）根据遗传表型进行筛选的方法 （1）抗生素抗性筛选 （2）β-半乳糖苷酶系统筛选 （二）根据重组子结构特征进行筛选的方法 方法： （1）抗生素抗性筛选: 大多数载体均带有抗生素抗性基因 （一）根据遗传表型进行筛选的方法 b.插入失活法:外源基因插入到一个抗性基因位点，使 此种抗生素抗性消失，重组体转化的细菌不能在含有 这种抗生素的培养基中生长。 a.构建重组体时，保留了抗性基因活性，所转化的细胞 就能在含此种抗生素的培养基中生长,未转化的细胞 则不能生长。 * * * 第七章重组DNA技术 (Recombination DNA Technology) 第一节 基 本 概 念 重组DNA技术： 是指在基因水平上，将目的DNA在体外重组于能自我复制的载体DNA分子上，然后将重组DNA导入宿主细胞中进行增生，以获得大量的目的DNA片段，或以此为基础，通过基因的诱导表达，得到大量相应蛋白质产物的过程。 又称为分子克隆技术或基因工程技术 第二节 重组DNA技术的发展史 基因工程的诞生 1、Berg的开创性实验－第一个实现DNA重组 1980年Nobel化学奖 猴病毒SV40的DNA+λ噬菌体的DNA 2、Boyer-Cohen实验－第一个取得基因工程成功 1973年构建双重抗药性重组质粒 1973年是基因工程诞生的元年 第三节 工具酶 Werner Arber 理论预见限制酶 Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶 Daniel Nathans