聂呈荣博士学位论文具体试验方法.docVIP

聂呈荣博士学位论文具体试验方案 论文内容：转Bt基因玉米生理生态变化及其对土壤生态系统的影响 Bt玉米抗虫机制分析 Bt玉米遗传分析 Bt抗虫蛋白在不同生长时期各器官中的表达量。 植株及根系分泌物中有机酸及与抗性有关的次生代谢物——丁布含量的变化。 叶片中与抗性有关的过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、脂酶（EST）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）等的等位酶酶谱分析及酶活性变化。 转基因玉米根、茎、叶的表皮和皮层结构结构的变化，是否有利于抵御害虫侵袭。 Bt基因导入对受体玉米植株在正常栽培条件下（旱地种植及水培两种情况）和环境胁迫下生理生态的影响 不同干旱胁迫下转基因玉米叶片丁布含量水平的变化 不同光照条件下转基因玉米叶片水分生理、光合与呼吸代谢的变化 不同养分（氮素）水平下转基因玉米植株的氮素代谢的变化 Bt基因玉米对土壤生态系统的影响 根系分泌物组分分析 对根际微生物类群的影响 对土壤微生物类群的影响 对土壤呼吸的影响 对土壤酶活性的影响 植株分解速度和分解率测定 试验设计 试验设计方法：整个试验分成三个部分进行。 （一）田间随机区组试验：以美国先锋公司的1对玉米品种（Bt玉米和相应的非Bt玉米）和中国农大的1对玉米品种（Bt玉米和相应的非Bt玉米）共4个品种为材料进行随机区组试验，4次重复。小区面积0.8 m × 3.4 m。每个小区各品种种植10株。各小区在整个生育期取样6次，每次取单株（为避免种植过密的影响，取样时采取成对随机间隔取样法）。取样前测光合与呼吸速率。取样后，植株地上部一小部分即时用来检测Bt蛋白含量、内源激素、丁布含量及抗性酶活性，剩余部分超低温保存进行分子检测及测各种物质含量；土壤及根系样品用来测定根系活力、检测测根际微生物类群、土壤微生物类群、土壤呼吸和土壤酶活性。最后，每个小区各剩余4株，成熟后测产及考种，成熟植株用于分解实验。（各品种用种总量：40粒）。 1.实验目的： 对具有4个品种、4次重复的随机区组实验结果进行统计分析（方差分析）。 重点比较Bt玉米及其近等基因系的差别，中国种与美国种的差别。即进行t测验。 2.注意事项： 开花时，必须给雌穗套袋 实验前，为了保证含有与玉米相关的微生物，种植玉米的土壤必须含有部分原玉米地的土壤，并且全部土壤要混均匀。 3.田间随机区组试验具体排列图： 温室旁公路 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A D B C B A C D D A B C C B A D Ⅳ Ⅲ Ⅱ Ⅰ 其中，A为美国Bt玉米（B24），B为美国Bt玉米近等基因系（B23），C为中国为Bt玉米（1426×1482），D为中国Bt玉米近等基因系（农大3138） 。其余2对美国种为P66、P67；G30、G26。 6次取样顺序（前5次成对随机抽样决定，第6次在剩余的双数中随机抽一个）：1，5，9，3，7，6。 （二）水培试验：以美国先锋公司的3对玉米品种为材料进行砂培实验，了解转基因玉米在不同环境胁迫条件下的表现（该研究可以反映外源基因导入对受体在逆境条件下植物基础代谢的影响）。试验设三种光照水平、三个氮素水平和三个干旱胁迫水平，采用L9（34）正交表设计，6次重复。主要测定指标为：分前、中、后三个时期测定光合速率、气孔导度、呼吸强度、氮素代谢指标和有关物质含量等指标，培养液用来测根系分泌物里的有机酸和丁布含量。 （三）植株分解试验:以盆栽实验最后一次测定产量后剩余的玉米植株为材料,每个品种分别装入三个网袋,3次重复,随机区组排列埋入土中。分别在埋后1、2、3个月后测定分解率。 各项目测试方法 玉米植株中丁布、激素含量及根系分泌物测定：HPLC（先摸条件，参照曾任森、孔垂华、彭新湘、严小龙等实验室的方法进行）。 光合效能、水分生理与呼吸代谢检测：光合作用测定仪下测定。 分子水平变化检测：RAPD法。 Bt杀虫蛋白含量的测定：ELISA半定量试剂盒 与抗性有关的过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、脂酶（EST）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）等的酶活性：离心—分光光度检测法（参考邹琦的实验指导书） 植株的氮素代谢和物质含量测定：离心—分光光度检测法（参考邹琦的实验指导书） 微生物测定：土壤微生物计数采用稀释平板法。细菌采用牛肉蛋白胨培养基;真菌采用马丁氏琼脂培养基;放线菌采用高泽一号琼脂培养基 (中国科学院南京土壤研究所微生物室.土壤微生物研究法[Ｍ].北京:科学出版社,1985.85-176)。 土壤酶活性测定：测定土壤酶活性所用土样采用每盆三点取样,处理内土样充分混合均匀,然后用对角线均分法制作，风干、去杂和过筛后测定土壤酶活性。碱性磷酸酶活性的测定采用ДЖ