医用消毒型超声耦合剂体外细胞毒性检测的探讨[权威资料].doc

医用消毒型超声耦合剂体外细胞毒性检测的探讨 本文档格式为WORD,感谢你的阅读。 　　【摘 要】应用MTT比色法和琼脂扩散法检测医用消毒型超声耦合剂的体外细胞毒性。用MTT比色法检测时，同一浸提液在细胞接种密度高时，显示出的毒性级别低，反之亦然。同一试验材料采用琼脂扩散法检测时的结果与MTT比色法有区别。由于MTT比色法具有定量评价的优点，更适合耦合剂产品的体外细胞毒性检测。但是由于消毒型耦合剂含有消毒剂成份，在评价其毒性时应充分考虑到消毒剂对细胞的毒性作用，明确试验条件和浸提液制备方法。建议进一步完善医用超声耦合剂产品的体外细胞毒性检测方法。 　　【关 键 词】医用消毒型超声耦合剂；细胞毒性；琼脂扩散法；MTT比色法 　　R187 A 　　医用超声耦合剂发端于西方发达国家，是超声诊断与治疗操作中的专用制剂，然而，迄今为止国际组织和发达国家均不曾制定过相应的技术标准[1]。为了确保其符合安全、有效的原则，第一版的耦合剂行业标准由国家食品药品监督管理局于1998年颁布实施。随着耦合剂产品的发展，除了用于完好皮肤的普通型制剂外，还出现了无菌型及消毒型等类型的产品。2010颁布实施的新版医用超声耦合剂标准（YY0299―2008）对该类产品的生物相容性提出了要求。标准中要求按照GB/T16886.5-2003中规定的直接接触法进行试验，在短时间（24h以内）接触条件下，产品应无细胞毒性[2]。细胞毒性试验作为评价材料毒性的重要指标，以其简便、快捷、灵敏性高、重现性好、节省动物，并且试验结果有一定的临床相关性等优点被列为首选试验项目[3]。GB/T16886.5-2003中规定了3类试验方法，即浸提液试验、直接接触试验以及间接接触试验（包括琼脂覆盖法和滤膜扩散法）[4,5]。ISO10993-5:2009标准的附录C规定了MTT法检测细胞毒性的试验步骤。本试验选取了消毒型超声耦合剂，在不同的试验条件下采用MTT法以及间接接触法中的琼脂覆盖法对其进行细胞毒性评价，以探讨消毒型医用超声耦合剂体外细胞毒性的检测方法。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　试验细胞选取L929小鼠成纤维细胞株，购自中国科学院上海细胞所。主要药品与试剂：RPMI1640培养液（GIBCO，USA），胎牛血清（杭州四季青生物工程公司），MTT（AMRESCO，USA），DMSO（AMRESCO，USA）。 　　1.2试验方法 　　1.2.1四唑盐（MTT）比色法 　　取消毒型医用超声耦合剂，按照1mg/mL、5mg/mL、25mg/mL、100mg/mL及200mg/mL的比例分别加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液并置于37℃放置24h制备浸提液。取高密度聚乙烯浸提液作为阴性对照品；5%的DMSO溶液作为阳性对照。将培养至近汇合的L-929细胞消化，稀释为1×104U/mL及1×105U/mL，分别接种于96孔培养板中，每孔加入100μL。在37℃、5%CO2培养箱中培养24h，待细胞贴壁后将每孔中原培养液吸除，空白对照组加新鲜培养液200μL，各组加200μL不同浓度的浸提液以及阴性和阳性对照样品浸提液，置CO2培养箱中继续培养。于更换培养液后的24h将细胞接种密度为105个的培养板取出，置倒置显微镜下观察细胞形态。并每孔加入20μL质量浓度为5g/L的MTT溶液，继续培养4h后弃去孔内液体，加入200μL DMSO，置振荡器上振荡10min后，选择570 nm 在ELX800UV型酶标仪上测定光密度（optical density, OD）值，按以下公式计算相对增殖率(relative growth rare，RGR)：RGR=实验组吸光度值／对照组吸光度值×100％，并判定细胞毒性级别。 　　于更换培养液后的72h将细胞接种密度为104个的培养板取出重复以上MTT实验。 　　1.2.2琼脂扩散法 　　将培养至近汇合的细胞稀释成2.5×105U/mL接种于6孔培养板中，设阴性对照组、阳性对照组及样品组，每组设3个平行样，各孔加入2mL，放于CO2培养箱中培养至近汇合状态。将溶化的琼脂培养基与2倍浓缩的含10％血清的RPMI 1640培养基等比混合制成混合琼脂培养基，使琼脂的最终浓度为2％。弃去上清后每孔加入2mL混合琼脂培养基，待琼脂层凝固后，分别加入2mL新鲜配制的0.01%中性红活体染色剂，置于暗处染色20min后取出，吸除多余的染色剂，分别取无菌型及消毒型医用超声耦合剂均匀涂布于无菌滤纸片上并放置于固化的琼脂层上，样品约覆盖细胞层表面十分之一，阴性对照选用直径约5mm、厚约2mm的高密度聚乙烯圆片，阳性对照选用直径约