普通PCR仪和荧光定量PCR仪的使用幻灯片.pptVIP

Part II PCR原理 Part II PCR原理 Part II PCR原理 Part II PCR原理 Part II PCR原理 PCR仪软件操作指南： PCR仪软件操作指南： PCR仪软件操作指南： PCR仪软件操作指南： PCR仪软件操作指南： PCR仪软件操作指南： PCR仪软件操作指南： 关机操作： 实验结束后点击Exit至出现主界面，关闭PCR仪电源开关； 均匀用力将反扣部分抬起，向后平推PCR仪顶盖，取出PCR薄壁管。 向前平推PCR仪顶盖。 首先，传统的PCR 检测方法在测定PCR 扩增产物前需打开反应管，容易造成产物污染，成为“假阳性”的主要来源。实时PCR 在扩增过程中动态检测，完全以闭管方式进行，不仅操作简便，也杜绝了产物污染源。 其次，传统PCR 都是在PCR 到达平台期后进行检测。PCR 经过指数期后，对反应条件的变化十分敏感，扩增到达平台期的信号强度重现性很差。实时PCR 方法则在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此具有重复性。 定量PCR技术的产生 1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB内插染料法插至双链DNA，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度 PCR循环 = 双链DNA = 染料 = 荧光 后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB Part IV 荧光定量PCR原理 * * 二○一二年十二月 普通PCR仪和荧光定量PCR仪的使用 Part I 中心PCR (polymerase chain reaction)仪 简介 Part II PCR 原理 Part III 普通PCR仪操作规程 Part Ⅳ 荧光定量PCR原理 Part Ⅴ 荧光定量PCR仪操作规程 Part I 中心PCR仪简介 荧光定量PCR仪 Rotor gene 3000 普通PCR仪 Gene AMP System 9700 AAAA 蛋白/酶 DNA mRNA 蛋白 中心法则 基因表达 转录水平 翻译水平 基因水平 （Real time） RT-PCR Western blot PCR 核酸的功能是储存 和转移遗传信息， 指导和控制蛋白质的合成； 而蛋白质的主要功能是 进行新陈代谢活动和 作为细胞结构的组成成分。 PCR概念 利用DNA聚合酶、一对引物和四种dNTP（三磷酸脱氧核苷酸），对模板DNA反复多次地进行复制，从而得到大量扩增产物的反应过程，称为PCR。 PCR反应五要素 引物（primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP（dATP, dGTP, dCTP, dTTP） Mg2+ （magnesium） 模板 （template） PCR扩增的基本反应步骤 1、变性：加热至95oC左右，使模板DNA变性。 2、退火：降低温度至适合的温度（55oC左右，引物与模板 DNA的互补序列配对结合。 3、延伸：温度在70oC左右时，Taq DNA聚合酶从引物3端催化复制链以5 -3方向延伸。 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1-3步 25-30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 Part II PCR原理 PCR原理 PCR的理论方程：Y=x×(1+ Ev)n Y：扩增物数量； X ：起始模板数量； Ev：扩增效率； n：扩增循环数 Part III 普通PCR仪操作规程 开机操作： 打开PCR仪电源开关； 向后平推PCR仪顶盖，放入PCR薄壁管。 向前平推PCR仪顶盖，并均匀用力将反扣部分压下。 注意： 9700PCR仪必须使用圆头的PCR薄壁管。 Part III 普通PCR仪操作规程 Gene Amp PCR System 9700 Version 3.05 User:*** Run Creat Edit Util User F1 F1 F2 F3 F4 F5 1 4 7 Enter 2 5 8 0 3 6 9 CE Stop Part III 普通PCR仪操作规程 Select User Name precql lyf …… Accept New Edit Delete Cancel F1 F1 F2 F3 F4 F5 1 4 7 Enter 2 5 8 0 3 6 9 CE Stop Part III 普通PCR仪操作规程 User Name___ Use ENTE