RT-PCR幻灯片.pptVIP

一、定义 二、逆转录 过 程 试管内逆转录反应 First strand cDNA synthesis反应体系的基本成分 随机引物法是三种方法中特异性最低的 引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。 Oligo(dT)比随机引物特异性高 它同大多数真核细胞mRNA 3‘端的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。 基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。 三、聚合酶链式反应--PCR 一种将微量的目的DNA片段在体外快速、大量 扩增的技术。 以目的DNA（待扩增DNA）分子为模板，以一 对分别与模板3’末端互补的寡核苷酸片段为引物， 在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着 模板链延伸直至完成2条新DNA链的合成。不断重复 这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。 PCR