通过DNA改组技术定向进化赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldc.PDFVIP

第 １３卷第５期 生　 物　 加　 工　 过　 程 Ｖｏｌ１３ Ｎｏ５ ２０１５年９月 ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｅｐ２０１５ － ｄｏｉ：１０３９６９／ ｊｉｓｓｎ１６７２ ３６７８２０１５０５００４ 通过ＤＮＡ 改组技术定向进化赖氨酸脱羧酶 基因ｃａｄＡ和ｌｄｃ 张　 凯，蔡　 恒，汪　 晨 （南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００） 摘　 要：利用ＤＮＡ改组技术对赖氨酸脱羧酶野生型基因ｌｄｃ进行随机突变，在大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ 中构 建赖氨酸脱羧酶突变体库。 从Ｅ． ｃｏｌｉＪＭ１０９和蜂房哈夫尼菌Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ ＡＳ１１００９ 中分别克隆出赖氨酸脱羧酶基 因ｃａｄＡ和ｌｄｃ。 查询ＮＣＢＩ数据库得知，二者的同源性为７５％。 分别构建重组质粒ｐＴｒｃ９９ａ ｃａｄＡ和ｐＴｒｃ９９ａ ｌｄｃ， 以此２种质粒为模板，经ＰＣＲ扩增，获得目的基因片段，分析目的基因片段中存在的限制性酶切位点，用多种限制 性内切酶碎片化２种基因，切割成不同大小的片段。 这些小片段进行不同组合，突变体经过ＬＢＸＬ平板初筛和高效 液相色谱（ＨＰＬＣ）复筛，获得 １株酶活性提高的赖氨酸脱羧酶突变体，编号为ＬＤＣ２ １６，其比酶活为４ ８６９８６ Ｕ／ ｍｇ（以１ｍｇ 总蛋白计），与２种野生型赖氨酸脱羧酶基因表达的酶ＣａｄＡ（１６５２６３Ｕ／ ｍｇ）、Ｌｄｃ（２３６５９３Ｕ／ ｍｇ） 相比，在最适温度３７ ℃、ｐＨ６０ 时，突变体的比酶活分别是上述野生型酶的２９５和２０６倍。 摇瓶发酵５ ｈ后，目 标产物１，５ 戊二胺产量从４６９提高至６３９ ｇ／ Ｌ，提高了３６％。 关键词：ＤＮＡ改组；定向进化；赖氨酸脱羧酶；蜂房哈夫尼菌；大肠杆菌 － － － 中图分类号：Ｑ９３　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２ ３６７８（２０１５）０５ ００２０ ０６ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ｌｙｓｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｃａｄＡ ａｎｄ ｌｄｃ ＺＨＡＮＧ Ｋａｉ，ＣＡＩ Ｈｅｎｇ，ＷＡＮＧ Ｃｈｅｎ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｗｏ ｌｙｓｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＬＤＣ） ｃａｄＡ ａｎｄ ｌｄｃ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｔｉｏｎ． Ｏｎｅ ｌｙｓｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｃａｄＡ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｌｄｃ ｆｒｏｍＨａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ ＡＳ１．１００９ ｗｅｒｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｎｔｏ ｖｅｃｔｏｒ ｐＴｒｃ９９ａ． Ｒｅｆｅｒｒｉｎｇ ｔｏ ＮＣＢＩ ｄａｔａｂａｓｅ，ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ７５％ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃａｄＡ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｌｄｃ ｇｅｎｅ． Ｔｈｅｎ，ｗｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｅｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＴｒｃ９９ａ⁃ｃａｄＡ ａｎｄ ｐＴｒｃ９９ａ⁃ｌｄｃ． Ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ，ｔｗｏ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ