PCR的种类及应用-xm2015幻灯片.pptVIP

标记引物 ＰＣＲ 观察 PCR产物 双脱氧核苷酸终止法 反应体系中包含：模板 DNA, Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测序引物； 反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般3~4 ：1)。 测序 * 少一个－OH 脱氧核甘酸 与 双脱氧核甘酸 结构比较 H ddNTPs 是反应终止剂，可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。 荧光标记ddNTP 荧光检测探头 电泳，看谁跑得快 原位PCR ??原位聚合酶链式反应（In Still PCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列 　 操作步骤 1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入。 2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检测扩增产物 A.阳性对照 B.阴性对照 C.原位检测mRNA表达 荧光化学方法 1）DNA结合染料（SYBR Green 1） SYBR Green 1 是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与dsDNA非特异性结合。在游离的状态下，SYBR Green 1发出微弱的荧光，但一旦与dsDNA结合，荧光强度增加1000倍。 缺乏特异性；不能用于多重反应，因为不能区分不同扩增子发出的荧光，用于单重实验 。 荧光定量PCR 2）荧光染料标记的序列特异性寡核苷酸引物或探针（TaqMan探针） Taqman探针3′端Q荧光分子能够吸收5′端R荧光分子发出的荧光,因此,正常情况下该探针检测不到5′端荧光分子发出的荧光,只能检测到3′端荧光分子的荧光信号,但当溶液中有PCR 产物(模板) 时,探针与模板退火,即产生了适合于核酸外切酶活性的底物,从而激活Taq 酶的5′外切酶活性,将探针5′端连接的R荧光分子从探针上切割下来,破坏了两个荧光分子间的FRET ,从而发出荧光,切割的R荧光分子数与PCR 产物的数量成比例,因此,根据PCR 反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量 分子信标（molecular beacon）是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。 Q-PCR的应用 （1）荧光定量PCR数据分析，绝对定量和相对定量。 生物学家通常对下列事情感兴趣：a)给定的血样中的病毒颗粒数；b)相当量的肿瘤组织和正常组织比，p53mRNA改变了多少倍。 （2）基因表达差异分析。 例如：与一个生物合成途径有关的三个基因（A、B、C），选择内参基因为β-actin，在两个样本（a、b）中的相对表达情况。 用TaqMan探针 进行多重实验扩增分析基因表达差异 （3）基因型/等位基因分析，例如SNP检测等 （4）转基因生物检测 ，比如可以准确的检测食品中某一种转基因成分的含量。其实就是跟野生型生物相比该基因表达量 巢式PCR 巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异 。 一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等 　　巢式PCR，可以在106基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，所以特异性很好，但也是最容易污染的PCR。 Touchdown PCR 用来避免非特异性序列的扩增 PCR中引物的黏合温度(annealing temperature)决定了黏合的特异性，温度越高特异性越强，但过高则不能实现引物和模板的结合，而过低会产生大量非特异性产物。因此进行PCR时需要寻找合适的黏合温度。 递减PCR开始先设定一个比较高的黏合温度，每个循环黏合温度下降1℃，到一个较低温度以后每个循环的黏合温度保持不变直到结束。在刚下降到特异性结合可以进行的最高温度时，可以达到最高的特异性。这样在起初的几个循环中，特异性扩增序列可以相对非特异性序列多扩增若干倍，从而减轻非特异性扩增对结果的干扰。这种方法可用于省去多次试验最佳黏合温度的工作。 * * * * * PCR的种类及应用 2