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土壤细菌多样性分析PCRDGGE技术优化 　　摘 要：变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）已经成为环境微生物多样性分析以及生态学研究中的重要技术，但昂贵的进口设备和比较复杂的操作，使得该技术在基层技术部门以及高等院校人才培养中的应用受到了限制。研究针对国产DGGE系统，采用研发的土壤DNA提取方法，以土壤细菌总DNA为模板，分别从DGGE电泳时间、引物实习、染色方法等方面进行了PCR-DGGE技术优化研究，获得了一整套的PCR-DGGE优化技术，试验结果稳定、可靠、重现性好，分辨率高，实用价值大。技术的主要关键点有：引物对10F/1507R和引物对BV34F/BV56GC的巢氏PCR效果最佳。DGGE上样量50ul时在国产DGGE系统上DGGE胶浓度为6%、变性梯度为40%～60%、100V×12h、温度60℃、EB染色15min，得到的DGGE指纹图谱效果理想，该优化技术完全可以满足对土壤细菌遗传多样性分析的要求，且运行成本低，对促进土壤微生物多样性的研究与相关教学实践具有重要意义。 　　关键词：土壤；细菌；多样性；DGGE 　　土壤中微生物种类极其丰富，文献曾报道，1g农田土壤中就含有几百万细菌、数十万真菌孢子和数万个原生动物和藻类[1]。微生物以它所具有的各种生物化学活性 ，积极参与土壤中各种物质的转化过程 ，是土壤中各种生物化学和生理学过程动态平衡的主要调节者。目前在生态学和环境科学的研究领域，关于土壤微生物尤其是土壤中微生物多样性及其在生态系统中的作用的研究越来越受到重视；而传统的平板培养分离方法研究土壤微生物多样性有很大的缺陷，能够人工培养的土壤微生物的数量只占其总数的1%左右[2]，且这种分离培养方法不能很好地反映土壤微生物多样性的原始状态等[3]，这就使得采用新的技术和方法显得尤为必要。 　　变性梯度凝胶电泳技术（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）作为一种DNA指纹图谱技术，最先由Muzyer等于1993年将其应用于微生物生态学研究[4]，证实了该技术在研究自然界微生物群落的种群差异和遗传多样性方面具有明显的优越性。DGGE因其可靠、方便快捷、重现性好等特点，迅速成为微生物群落多样性和动态分析的强有力工具[5]。目前广泛运用于土壤、水体、食品、活性污泥等各种样品中的微生物多样性检测和种群演替的分析[6～9]。但昂贵的进口设备和比较复杂的操作，使得该技术在基层技术部门以及高等院校人才培养中的应用受到了限制。因此，选用适宜的引物，并对PCR及DGGE的实验条件进行优，以获得较好的分析结果显得尤为重要。本试验优化了DGGE电泳时间长度，筛选了最佳PCR引物，比较了两种染色方法，得到了在国产DGGE系统分析土壤微生物多样性的最佳条件。 　　1、材料与方法 　　1.1、试验材料 　　试验土壤样品21个，于2011年9月采自许昌市襄城县庾河村烟田。烤烟品种为当地主栽品种中烟100，种植方式为烟薯套种。对采集的土样自然风干，研磨过100#筛子，装袋标记，置于-20℃冰箱内以备用。 　　1.2、试验方法 　　1.2.1、土壤总DNA的提取 　　对处理过的土样采用本实验室优化方法提取土样总DNA。 　　1.2.2、PCR引物的设计和扩增体系的探索 　　（1） 引物合成 　　根据NCBI数据库公开的细菌基因组16S保守序列设计了4对细菌通用引物：引物对Eubac10F/Eubac1507R用于第一轮扩增，引物对BV34F/BV56GC、BV67F/BV89GC和BacGC-P2/BacGC-P3用于第二轮扩增，对样品总DNA进行巢氏PCR扩增。为了便于对污染源进行追踪，在PCR扩增过程中，都设立了阴性对照。对照除了不加模板DNA外，其它组分全部相同。引物序列均由北京博尚生物技术有限公司进行合成，详见表1： 　　（3）巢式PCR扩增条件： 　　引物对Eubac10F/Eubac1507R的第一轮PCR扩增程序为：95℃ 5min，1个循环；94℃ 50s，52℃ 50s，72℃ 1min，28个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖电泳。 　　引物对BV34F/BV56GC的第二轮PCR扩增程序为：95℃ 5min，1个循环；94℃ 40s，52℃ 45s，72℃ 45s，28个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测后用于DGGE电泳检测。 　　引物对BV67F/BV89GC的第二轮PCR扩增程序为：95℃ 5min，1个循环；94℃ 40s，54℃ 45s，72℃ 45s，28个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测后用于DGGE电泳检测。 　　引物对BacGC-P2/BacGC