optimuncondition是指能满足酶促反应速率达到最大反应速率所需条件.PPTVIP

第二十三章 临床酶学检验的原理和方法 * 第二节 酶活性测定的影响因素和最适条件 一、酶活性测定的最适条件 二、酶活性测定的影响因素 三、最适条件的确定 一、酶活性测定的最适条件 最适条件（optimun condition) 是指能满足酶促反应速率达到最大反应速率所需条件。 酶的催化活性与酶促反应的最大速率成正比例，只有当反应速率为最大反应速率时，V才与酶量E成正比例，也只有在此基础上建立起来的测定方法才可靠和准确。 测定酶活性浓度的推荐或参考方法都提出酶活性浓度测定的条件应是酶反应的最适条件。 最适条件主要包括： 1、合适的底物和足够的底物浓度。 2、理想的缓冲液种类和最适离子强度。 3、反应液的最适PH。 4、最适反应温度。 5、合适的辅因子、激活剂浓度。 6、酶偶联反应中最适的指示酶和辅助酶用量。 7、合理的测定时间，包括延滞期劲量短暂，有足够的线性期。 8、合适的样品与试剂比例。 9、足够的检测范围。 10、尽量去除各种抑制剂等。 （一）底物的确定 底物选择的原则： 1、尽量选择Km最小的底物， 最好是酶的天然底物。 2、要有足够的溶解度。 3、酶对底物特异性高。 4、底物稳定性好。 5、有较高的临床价值。 （二）底物浓度的确定 1、单底物酶促反应： 在反应速率为最大反应速率的一半时，[S]=Km，此时的底物浓度就相当于酶的米氏常数Km。以mol/L表示，大多酶Km在10 -10 mol/L之间。 若[S]=10Km，则反应速率达到最大反应速率的90.9%。 若[S]=20Km，则反应速率达到最大反应速率的95.2%。 只有当[S]无穷大时，反应速率才达到最大反应速率。 因此，底物浓度的确定原则是选择[S]=10~20Km，此时反应速率基本达到最大反应速率，测定的误差可以接受。 -3 -5 2、双底物酶促反应： 双底物酶促反应动力学与单底物相比更复杂，底物浓度的确定要以动力学方程为基础，可以用乒乓机制、序列有序机制和随机机制等进行分析。 双底物酶促反应速率达到最大反应速率的程度，一般要求90%-95%，根据不同机制的动力学方程，可以求出两底物的用量 双底物反应的动力学方程式可以用下式表示： （二）缓冲液的确定 缓冲液对酶活性的影响包括缓冲液的种类、离子强度和最适PH等方面。 1、缓冲液的种类：依据对酶活性的影响可将缓冲液分为活性缓冲液、惰性缓冲液和抑制缓冲液。 2、最适PH：在最终反应体系中，酶促反应速率达到最大时的PH称为最适PH。最适PH并非酶的特征性常数，易受多种因素如缓冲液种类、底物浓度、反应温度、样品与反应试剂的比例、防腐剂和添加剂等影响而改变。 3、离子强度：缓冲液的离子强度也会影响酶的活性，一般选择与体液比较接近的离子强度。离子强度越高，电解质会干扰酶与底物结合，酶活性将逐步降低，但离子强度过低也会抑制酶活性。 目前常用的缓冲液有：N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸 （HEPES )、N,N’-双（2-乙磺酸）哌嗪（PIPES)、 三羟甲基氨基乙烷（Tris)、三乙醇胺（TRA）、 二乙醇胺（DRA）、2-甲基-2-氨基-1-丙醇（AMP） 理想的缓冲液应有足够的缓冲容量、较强的缓冲能力和较高的纯度。 （三）反应温度的确定 在1986年以前IFCC推荐酶活性测定的温度为30℃ 2002年IFCC正式发表了“37℃下检测酶活性浓度的IFCC以及参考方法操作手册和参考制品认可体系。” 目前基本无异议，确定37℃酶活性测定温度。 （四）辅酶辅基和激活剂 结合酶是由酶蛋白和辅助因子组成的。根据酶催化反应最适条件的要求，原则上在酶测定体系中应加入一定量的辅酶、辅基和金属离子激活剂等辅助因子。 （五）抑制剂 酶活性测定过程中的抑制剂种类很多，有产物、底物，分析器材或试剂中的重金属及体液中的药物等。 采取的措施主要有：选用高纯度的原料、高纯净水、干净器材，在反应液中加入金属螯合剂，甚至可以引入一个副反应来去除产物的抑制作用等。 （六）酶偶联法中的指示酶和辅助酶 1、指示酶和辅助酶的种类 选择依据：①特异性要高，尤其是指示酶 ②辅助酶的数量尽量少，减少辅助酶就可以缩短延滞期 ③酶偶联反应要合理，如能直接与指示酶偶联，就没必 要加入辅助酶。 ④所选用的指示酶、辅助酶应尽量选择Km小的酶，以缩 短延滞期。 ⑤最适条件尽量与测定酶接近。 ⑥其他因素，包括稳定性、纯度、价格和来源等。 名 称 缩写符号 名 称 缩写符号 乳酸脱