基于NanoLCLTQOrbitrap技术蛋白质组学法探索人参干预气虚大鼠生物学基础.docVIP

基于NanoLCLTQOrbitrap技术蛋白质组学法探索人参干预气虚大鼠生物学基础 　　[摘要] 应用NanoLCLTQOrbitrap技术的蛋白质组学法探索人参干预“气虚”大鼠的生物学基础。采用“限食+游泳过度”的方法建立气虚大鼠模型，运用NanoLCLTQOrbitrap纳升液相质谱联用检测系统分析空白组、气虚模型组、人参组大鼠股外侧肌肉组织全蛋白。Protein Discovery软件进行蛋白质鉴定，SIEVE软件对所有样本蛋白进行相对定量分析。人参组与模型组相比较共发现26个与空白组趋势一致的显著差异蛋白，通过生物学功能分析发现，其主要可归为能量代谢相关蛋白、糖代谢相关蛋白、电解质平衡及物质转运相关蛋白、炎症相关蛋白和细胞骨架相关蛋白等。以上相关蛋白靶点及其涉及的生物体调控通路可能是人参对机体“气虚”症候发挥补气作用的生物学基础。 　　[关键词] NanoLCLTQOrbitrap； 气虚； 人参； 蛋白质组学 　　中医基础理论认为：“气”是构成人体和维持人体生命活动的最基本物质，流转于全身各脏腑、经络等组织器官，不断的推动和激发着人体的各种生理活动[12]。“气”之不足，脏腑组织功能、机体活动则明显减退。现代医学研究亦表明，气虚与高血压、糖尿病、冠心病、慢性心衰、中风、急性脑梗塞、乳腺癌等多种疾病的发生有着密切的关系[23]。探索“气虚”症候及其治疗机制的科学内涵是中医中药现代化研究的重要内容。 　　人参为《神农本草经》首上品，“补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目，开心益智”[4]。其大补元气之功，向来备受历代医家推崇。 　　蛋白质组学（proteomics）是一门大规模、高通量、系统化的研究某一类型细胞、组织或体液中的所有蛋白质组成及其功能的新兴学科[5]，是继基因组之后又一重要生命科学研究领域，也是功能基因组时代的核心内容之一，为生物系统重要组成部分。其以“整体、系统”为特点的组学方式探索蛋白层面变化规律与中医症候“整体观”、中药治疗“多靶点”格局十分吻合[6]。 　　传统的蛋白质组学实验[7]采用基于双向电泳的蛋白质分离方法与常规质谱检测技术，难以实现真正意义上的高通量，高精准无缝衔接的组学研究。本实验在中医药理论指导下，采用NanoLC耦合LTQOrbitrap质谱检测系统，运用比较蛋白质组学方法寻找人参调节“限食+游泳过度”所致气虚动物的差异蛋白，结合生物学功能分析，探索人参大补元气的生物学基础。 　　1 材料 　　1.1 动物 　　SD大鼠，雌雄各半，体重230～250 g，SPF级，由湖南斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（湘 　　1.2 药品与试剂 　　人参颗粒（广东一方制药有限公司，批号401208T）；乙腈（HPLC级，德国默克，批号JAO28730）；甲酸（Sigmaaldrich，USA，批号BCBP4740V）；RIPA高效裂解液（Thermo Pierce，批号QB212494）；苯甲基磺酰氟（PMSF）（Thermo Pierce，批号QE2016716）；二硫苏糖醇（Thermo scientific，批号QE217272A）；碘代乙酰胺（Thermo scientific，批号QE216501）；测序级胰酶（Promega，USA，批号0000153715）；乙酸（HPLC级，Sigmaaldrich，USA，批号BCBN4472V）；丙酮（HPLC级，国药集团，批；碳酸氢铵粉末Sigmaaldrich，USA，批号BCBN6056V）；BCA蛋白定量试剂盒（Thermo scientific，USA，批号QH220534A）。 　　1.3 仪器 　　ORBITRAP ELITE质谱仪（Thermo公司）；EASYnLC 1000液相仪（Thermo公司）；分析天平（梅特勒公司）；C18旋转柱 （Thermo Pierce公司）；D37520高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；ELX800吸收光酶标仪（美国BioTek仪器有限公司）；离心浓缩仪（LABCONCO，美国）；EASYSpray Column（Thermo，美国）；Acclaim PepMap 100（Thermo，美国）。 　　2 方法 　　2.1 实验造模、分组及给药[8] 　　实验前将所有动物进行预游泳，剔除差异大的动物，保留游泳时间在10～50 min的合格大鼠。将合格大鼠按体重随机分为空白组、气虚模型组、人参组，每组10只。除空白组外，其余大鼠每天上午8：00、晚上6：00置于恒温水槽[（23±1）℃，水深40 cm]中负重（8%）力竭（游泳最后下沉，经10 s后仍不能返回水面即为力竭）游泳，并隔日禁食，隔日按1