基于空间阻滞新型高灵敏电化学传感器检测三磷酸腺苷研究.docVIP

基于空间阻滞新型高灵敏电化学传感器检测三磷酸腺苷研究 　　摘 要 构建了检测ATP的新型高灵敏电化学传感器，采用扫描电镜、荧光显微镜成像技术、微分脉冲伏安法及电化学阻抗法进行表征。传感器以硅纳米颗粒通过多段DNA链与氧化铝纳米孔膜形成的三明治结构阻碍离子传导， ATP存在下，传感器中的三明治结构被破坏，使离子通道顺畅，通过检测其电流变化值达到检测目标物ATP的目的。硅纳米颗粒的应用提高了检测灵敏度，降低了背景信号；而且仅需极少量的样品即可实现对ATP的检测。结果表明，此传感器对ATP检测的线性范围为0.025～0.900 nmol/L，检出限为13 pmol/L（S/N=3）。当样品中有100倍目标物浓度的共存物质存在时，传感器仍显示出对ATP的高特异性。此传感器构建简单，再生性好，可实现对小鼠血液中痕量ATP的检测，有望应用于临床医学检测、医药工业和环境检测等领域。 　　关键词 三磷酸腺苷； 氧化铝纳米孔膜； 硅纳米颗粒； 生物传感器 　　1 引 言 　　三磷酸腺苷（Adenoine triphosphate， ATP）是一?N多用途化学信号传导剂，在生命体的信号转导也起着中心作用。此外ATP在环境监测、药物分析以及生命科学等领域也具有重要作用[1～3]。目前，检测ATP的方法主要有比色法[4，5]、液相色谱法[6]、荧光分析法[7～9]、化学发光法[10]和电化学方法[11]等。Liu等[12]利用硫磺素（ThT）的荧光增敏效应设计了可灵敏检测ATP的方法，Chen等[13]利用纳米金聚集性能建立了测定ATP的比色方法。在目前所使用的方法中，实验操作繁杂、所用试剂制备困难、需要昂贵的仪器等缺点限制了方法应用。近年来，纳米孔作为一种能与适配体联用并具有智能响应的纳米器件在生物分析领域引起了广泛关注，在提高检测方法的灵敏度及特异性方面有显著优势。 　　本研究将具有高特异性的适体与具有智能响应的氧化铝纳米孔膜（PAA）相结合构建生物传感器，实现了对小鼠血液样品中痕量ATP的高灵敏、高选择性检测。传感器工作原理如图1所示，首先，在PAA孔道内修饰能与ATP适体（H4）3′端部分互补的核苷酸链（H1），在二氧化硅纳米粒子（SiO2NPs）上修饰可与H4链5′端部分互补的核苷酸链（H2）。在H4存在下，PAA/H1和H2/SiO2NP可在PAA孔道内形成具有三明治结构的PAA/H1/H4/H2/SiO2NPs复合体。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　CHI832电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）； IX51奥林巴斯倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）。氧化铝纳米孔膜（PAA， 直径25 mm，厚度为60 μm，孔径为200 nm，上海上木科技有限公司）。3氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）、三氯乙酸（TCA）、三磷酸腺苷（ATP）、胞苷三磷酸（CTP）、三磷酸鸟苷（GTP）、三磷酸尿苷（UTP）、二磷酸腺苷（ADP）和腺苷单磷酸（AMP）等购于国药集团有限公司（上海）。核苷酸序列：H1：5′NH2TTTT TTTTTTTTTTTCTTCCTCCGC3′，H2：5′ACTCCCCC AGTTTTTTTTTTNH23′， H3：5′6（FAM）ACTCCCCC AGTTTTTTTTTTNH23′，ATP适体 H4：5′CTGGGGG AGTATTGCGGAGGAAG3′，均经HPLC纯化并由上海生工有限公司合成。所用试剂均为分析纯，TrisHCl缓冲液（15 mmol/L KCl，4 mmol/L MgCl2和10 mmol/L TrisHCl， pH=7.4），实验用水均为超纯水（超纯水仪，上海纯浦实业有限公司）。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 H2/SiO2NPs的合成 单分散性的二氧硅纳米粒子（SiO2NPs）采用文献[14]的溶胶凝胶法合成，浓度约0.5 g/L。 在5 mL SiO2NPs乙醇分散液中加入60 μL APTES、 5 mL 1.05%丁二酸酐DMF溶液，室温搅拌24 h后，悬浮于10% DMSO pH 7.4缓冲液中，加入6.0 nmol H2或H3、 0.02 g EDC，37℃水浴中振荡过夜，离心、洗涤，分散于200 μL TrisHCl缓冲液，浓度约为0.25 g/L。 　　2.2.2 PAA/H1修饰电极的制备 PAA电极浸入含有25%APTES的丙酮溶液，持续5 h，乙醇和水交替冲洗后，置于2.5%戊二醛溶液中，避光孵育过夜；洗涤后浸入1 mL含100 nmol/L H1、 0.1 g EDC和25% DIPEA 的TrisHCl缓冲液中， 37℃恒温振荡孵育过夜，取出后用TrisHCl缓冲液洗涤， 除去游离的H1， 得到H1修饰的PAA电极。