基于绿色荧光蛋白瞬时表达植物亚细胞定位方法.docVIP

基于绿色荧光蛋白瞬时表达植物亚细胞定位方法 　　摘要：细胞是生命活动的基本单位，各种蛋白质都按照其功能有序地分布在细胞的每个分区中。蛋白质的亚细胞定位是功能基因组学的重要内容。目前植物蛋白质的亚细胞定位方法中应用较普遍的是借助于报告基因表达产物来实现目标蛋白定位的融合报告基因定位法，其中绿色荧光蛋白应用最为广泛。综述了基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物亚细胞定位方法，包括拟南芥原生质体瞬时表达、烟草叶片瞬时表达、洋葱表皮细胞瞬时表达等，同时对上述几种方法进行了比较分析。 　　关键词：蛋白质；亚细胞定位；绿色荧光蛋白；瞬时表达 　　中图分类号： Q-33文献标志码： A 　　文章编号：002-302（204）2-0058-04 　　蛋白质是生物功能的直接体现者，有序分布、动态调控的蛋白质是保证生命个体正常生长发育的前提。基因表达产物在组织中的亚细胞定位是功能基因组学、蛋白质组学的重要研究内容之一，是系统理解植物形态建成、生长发育以及对逆境的耐受性、抵抗性不可或缺的环节，也是生物学家们初步推断蛋白质生物学功能的重要依据。蛋白质的亚细胞定位可采取多种方法，包括生物信息学预测、免疫胶体金标记[2]、多肽序列分析[3]以及与报告基因融合瞬时表达[4]等。目前植物蛋白的亚细胞定位应用主要是借助于融合报告基因定位法，其中绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GF）应用最为广泛。瞬时表达技术结合报告基因，可以有效跟踪融合产物在细胞内的运输、亚细胞定位及代谢[5]。GF是水母（Aequorea victoria）体内的天然蛋白，自994年Chalfie等揭示了该蛋白作为报告蛋白的潜在应用价值[6]以来，已作为报告蛋白在多种植物、动物、微生物中成功获得表达。由于GF作为报告蛋白不需抗体、辅助因子、酶底物等其他成分，也不影响宿主细胞，因而可以鉴定、跟踪、分选表达GF的细胞；同时可以在活细胞中进行图像分析，在固定细胞中进行检测[7]。瞬时表达（transient expression）是指引入细胞的外源DNA与宿主细胞染色体DNA并不发生整合，而是随载体进入细胞，约2 h左右可表达，基因产物在2～4 d内即可被检测出，是种快速研究基因表达、蛋白质亚细胞定位及基因间互作的重要手段。瞬时表达能表达多种外源基因，具有时间短、重复性好等优点，弥补了常规转基因方式中周期长、转化效率低等缺点[8]。与传统的转基因相比，瞬时表达不需要整合到染色体上，因此具有简单、快速、周期短、准确等优点[9]。瞬时表达不受基因位置效应、基因沉默的影响，表达效率较稳定，转化率高。目前，植物瞬时表达系统已被陆续应用到生物学研究中，如利用该系统进行基因功能的鉴定分析、发现新型强启动子、蛋白质互作、亚细胞定位等。亚细胞定位瞬时表达的宿主载体主要有拟南芥原生质体、烟草叶片、洋葱表皮细胞等。本研究对常用的基于绿色荧光蛋白瞬时表达的植物蛋白质亚细胞定位方法进行总结，并对相关研究进行展望，以期更高效地进行植物蛋白质的亚细胞定位。 　　拟南芥原生质体瞬时表达 　　拟南芥瞬时表达系统由en Sheen教授实验室建立并完善[0]。该方法在蛋白定位、启动子研究以及蛋白质相互作用等方面很有效。拟南芥（Arabidopsis thaliana）是种模式植物，一直以来，拟南芥原生质体都是植物基因工程、植物细胞学研究的经典材料。原生质体作为种细胞水平的研究系统，由于没有细胞壁等特点，它可以排除细胞之间的相互影响，单独考察个细胞的全能性。原生质体是个均一性程度很好的群体，并且在短时间内就能获得大量原生质体。原生质体是个理想的试验系统，由于不受植物细胞壁的限制，其质膜经一定处理可以摄取外源物质（如细胞器、病毒、DNA等），是遗传转化的理想受体系统。研究表明，不同植物材料所得到的原生质体可以保持原组织的生理生化特性，可以取代植物组织作为理想的试验材料。 　　EG-Ca2 介导转化法 　　聚乙二醇（EG）作为种高分子化合物，20%～50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，使原生质体很快发生收缩。EG也能连接Ca2等阳离子，Ca2可在带负电荷的质粒DNA、EG之间形成桥，从而促使质粒进入原生质体。EG-Ca2介导的转化是拟南芥瞬时表达体系最常用的方法。该方法的技术流程是：拟南芥土培3～4周，生长过程中要求光周期较短（～2 h）。用解剖刀将符合要求的叶片切成细小的小段，溶于5 mL酶液中（纤维素酶0225 g，离析酶02 5 g，甘露醇64 g，pH值为57的MES 5 mL，55 ℃ 0 min，冷却至室温，再加入 mol/L CaCl2 5 μL、β-巯基乙醇525 μL、牛血清白蛋白BSA 50 μL，加dd H2O至5 mL）。避光抽真空 h，40 r/min慢摇4 h