基于线粒体COⅠ基因大小蠹属昆虫DNA条形码研究.docVIP

基于线粒体COⅠ基因大小蠹属昆虫DNA条形码研究 　　摘要：大小蠹属昆虫是重要的林木害虫，大部分种类是检疫性有害生物，我国口岸有多次截获记录。为加强对大小蠹属害虫的检疫鉴定，通过线粒体DNA细胞色素氧化酶C亚基Ⅰ基因（COⅠ）867 bp片段序列对大小蠹属17个种类进行序列分析，结果表明，线粒体COⅠ基因可作为大小蠹属昆虫分类的依据；DNA条形码是生物系统分类分子水平上的依据。 　　关键词：大小蠹属；线粒体基因；遗传距离；COⅠ基因 　　中图分类号： S763.380.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0030-03 　　目前，世界范围内已报道大小蠹属（Dendroctonus）昆虫19种[1-2]，作为鞘翅目中最进化的1个类群，其危害范围较广，是重要的森林害虫。大小蠹属为树皮小蠹类[3-4]，全部种类均侵食树干，成虫时初入侵韧皮部，后筑母坑道于形成层与边材之间。一般情况下，大小蠹属只危害活的直立木和由于年龄、干旱或其他生物学因素导致的衰弱木，在盛发期也危害茁壮的健康树，寄主包括松属、云杉属、黄杉属和落叶松属等经济树种。 　　目前，昆虫鉴定以传统的形态学鉴定为主，该方法存在一定的缺陷，表型可塑性（phenotypic plasticity）和遗传可变性（genetic variability）容易造成鉴定结果不正确，无法鉴定许多群体中普遍存在的隐存分类单元，受生物性别和发育阶段的限制，很多生物无法被鉴定。现代交互式鉴定系统是昆虫鉴定的一个很大进步，但它要求专业技术很高，操作不正确就易导致鉴定错误[5]。快速准确的物种鉴定是深入开展行为学、生态学以及生理学等相关研究的必要前提和基础[6]。 　　国内外大小蠹研究多集中于形态学分类，有关该类群分子鉴定技术的研究报道尚少。本研究通过对大小蠹属COⅠ基因片段序列进行比对，对同源序列碱基多样性及系统进化关系进行分析，以期利用DNA条形码技术快速、准确地鉴定大小蠹种类，为进一步研究小蠹科昆虫分子鉴定技术提供理论依据和实践基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 昆虫种类及序列信息 　　本研究以大小蠹属17个种类作为研究对象（表1），序列均从GenBank下载。 　　1.2 分析方法 　　应用MEGA5.05软件进行序列比对、拼接和剪切，基于Kimura 2-parameter模型，计算各分类单元之间的遗传距离及其标准差、序列碱基组成、保守位点、变异位点、转换/颠换比值等[7]。应用MEGA5.05软件，使用邻接法（NJ）构建分子系统树，1 000次循环估计系统树中节点的自举置信水平，碱基转换和颠换赋予相同的加权值，查看系统树[8]。 　　2 结果与分析 　　2.1 mtDNA COⅠ基因序列组成和变异 　　应用MEGA 5.05软件对17个大小蠹COⅠ基因序列比 　　对剪齐后保留了869 bp的序列，其中第1个碱基为第1个氨基酸密码子的启示位点，为分析方便，共保留867 bp进行序列分析。结果表明，在867个位点中没有插入和缺失现象，其中保守位点、变异位点和简约信息位点分别为525个、342个和248个，在867个位点中分别占60.6%、39.4%和286%；A、T、C、G平均含量分别为30.2%、37.9%、16.8%、15.1%，A+T含量较高，为68.1%。另外，虽然不同密码子的A、T、C、G含量不相同，但都表现出明显的A+T含量偏向性，特别是在密码子的第3位，A+T含量高达83.1%，与典型的昆虫线粒体DNA碱基组成一致。密码子第3位点G含量较少，只有4.6%，并且在不同种间差异较大（2.1%～74%），C含量在不同种群间差异也很大（6.4%～20.9%）。 　　2.2 碱基替换分析 　　采用MEGA5.05软件对所测基因序列替换数进行估计，由表2可见，17种大小蠹COⅠ基因867个核苷酸序列中，核苷酸替换多为同义替换（ii）。全组数据转换与颠换的平均比值为1.79，在第1、2、3位点的比值分别为3.63、1.68、1.58，转换较为频繁，这是昆虫mtDNA的一个普遍特点；转换发生以CT为主（73.0%），颠换以AT为主（933%）。转换与颠换主要发生在密码子第3位点上，转换58个，其频率为总数的77.3%，颠换37个，其频率为总数的881%；第2位点最少，只有2个位点发生了转换，1个位点发生了颠换，这与第3位点承担较小的遗传压力有关。 　　2.3 遗传距离分析 　　在分子进化过程中，多重替换的存在严重干扰了序列之间真正的遗传距离估算，很难直接从已对准的序列中计算出真正的遗传距离。要解决这个问题，就需要对多重替换影响下的序列进行校正。现在有一些方法对序列进化过程作出了不同的假设，在这些假设条件下来估计序列上核苷