塞来昔布通过Wntβ―catenin信号通路对人结肠癌细胞SW480影响.docVIP

塞来昔布通过Wntβ―catenin信号通路对人结肠癌细胞SW480影响 　　[摘要] 目的 观察非甾体类抗炎药塞来昔布对体外培养的人结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响，并研究其与Wnt/β-catenin信号通路的关系，探讨塞来昔布抑制结肠肿瘤生长的分子机制。 方法 应用MTT法测定不同浓度塞来昔布（0、20、40、60、80、100 μmol/L）对SW480细胞增殖的影响；应用流式细胞术分析不同浓度塞来昔布（0、20、40、80 μmol/L）处理48 h后对SW480细胞凋亡的影响；应用Western blot法分析不同浓度塞来昔布（0、20、40、80 μmol/L）处理48 h后SW480细胞中β-catenin蛋白和磷酸化的β-catenin蛋白的表达水平。 结果 MTT结果显示，塞来昔布对结肠癌细胞的增殖抑制有浓度依赖性和时间依赖性（P 0.05）；流式细胞术分析显示，随着塞来昔布浓度的增加，结肠癌细胞的凋亡率明显增加（P 0.05）；Western blot法检测结果显示，随着塞来昔布浓度的增加，β-catenin蛋白表达显著下降（P 0.05），而磷酸化的β-catenin蛋白表达显著升高（P 0.05），且呈剂量依赖性。 结论 塞来昔布可以抑制结肠癌SW480细胞的Wnt/β-catenin信号通路，这可能是其抑制结肠癌细胞增殖、促进凋亡的重要机制。 　　[关键词] 塞来昔布；结肠癌；Wnt信号通路；β-catenin 　　[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）07（c）-0054-04 　　随着人们饮食习惯的改变和生活环境的恶化，结肠癌的发病逐年增加，2014年全球估计新发病例数近137万例，居恶性肿瘤发病率的第3位[1]。大肠癌的发病机制复杂，其治疗包括手术、化疗、放疗及基因治疗在内的多种治疗方法。近年来非甾体类抗炎药（NSAIDs）的抗肿瘤作用日益受到人们的关注，其可以通过多种途径对肿瘤生长产生抑制作用[2-4]。而Wnt信号传导通路在结肠癌的发生发展中起着决定性的作用[5-8]，但NSAIDs塞来昔布对Wnt信号通路的作用机制尚不明确。本研究以人结肠癌SW480细胞为研究对象，观察塞来昔布对结肠癌SW480细胞增殖、凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的影响，探讨该作用与Wnt/β-catenin信号通路之间的关系，为其用于结肠的治疗提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要药品、试剂 　　人结肠癌细胞株SW480购自中南大学肿瘤研究所；塞来昔布（辉瑞制药公司，生产批号：M72189）；新生牛血清（杭州四季清公司）；RPMI1640（Gibco公司，USA）；胰蛋白酶（Amresco公司，USA）；BCA Protein Assay Reagent（PIERCE公司，USA）；兔抗人β-catenin多抗和磷酸化β-catenin多抗（Bioworlde Tecnology Inc公司，USA）；DMSO和MTT（Sigma公司，USA）；PVDF膜（Millipore公司，USA）；考马斯亮蓝、Western blot Luminol Reagent发光试剂和蛋白质分子量标准，Western blot凝胶试剂盒。 　　1.2 细胞培养 　　人结肠癌SW480细胞培养于体积分数为10%的新生牛血清和100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于环境为37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。取对数生长期的SW480细胞用于实验。 　　1.3 MTT比色法用于细胞生长抑制实验 　　取对数生长期的SW480细胞，将细胞以2×108/L的密度接种于100 mL培养瓶中，每瓶1 mL，再加完全培养基4 mL，培养24 h，同步化后，每瓶分别加入塞来昔布培养液，终浓度分别为0、20、40、60、80、100 μmol/L，对照组为0 μmol/L。每浓度设4个复孔，分别在加药后24、48、72 h后，避光下加入5 mg/mL MTT 20 μL，置培养箱内继续培养4 h，弃去培养液，加入二甲基亚砜（DMSO），10 min后酶标仪测490 nm处吸光度（A）值，计算细胞生长抑制率（IR）。IR的计算公式为：IR（%）=（对照组A值-实验组A值）/对照组A值×100%。实验重复3次。 　　1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 　　设对照组（塞来昔布为0 μmol/L）和实验组（塞来昔布为20、40、80 μmol/L）共4个组别，取对数生长期的SW480细胞用于实验。孵箱内细胞培育48 h后终止培养，胰酶消化后分别制成单细胞悬液。调整待测细胞密度为5×105个