高级生化的技术实验.ppt

实验目的 通过实验应该做到 学习设计实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生化实验仪器。 学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验。 掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。 实验记录与实验报告 实验前应认真预习，写好实验预习报告。实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量的数据。 实验预习报告格式 ① 实验原理 ② 实验方法与步骤（表格或流程式） ③ 主要仪器、材料 ④ 实验数据记录表格 ⑤ 预习遇到的问题 实验记录与实验报告 实验报告是学生实验研究结果的记录和总结，同时也是评价学生实验课成绩的重要依据。 实验报告的格式 ① 实验目的 　 ② 实验原理 　 ③ 实验方法与步骤　 ④ 实验数据记录、处理及结果分析 ⑤ 思考题 ⑥ 讨论、心得 注意：实验结果的讨论要充分，尽可能充分运用己学过的知识和生物化学技术原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。 实验一 鸡卵类粘蛋白的分离与纯化 【实验原理】 鸡卵类粘蛋白是一种糖蛋白，它具有强烈的抑制蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究，也可将其制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效的分离与纯化胰蛋白酶。另外，还可用于分离纯化麦胚凝集素。 透析纯化 离子交换层析后，样品中盐的质量较高，需要脱盐才能得到纯品，一般采用透析的方法。 4) 量取100mL Sephadex G-25,加入200mL pH6.5 的磷酸盐缓冲液，沸水中1h。冷却后脱气。 2) 装柱 （小心操作）。用pH6.5磷酸盐缓冲液平衡，直至流出液在蛋白质检测仪上绘出稳定的基线。 3) 蛋白样品中加入3倍体积的冷丙酮，用塑料薄膜封口，在冰箱静置4h。 实验二 SDS－PAGE测定蛋白质 相对分子质量 【目的要求】 学习SDS测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS测定蛋白质分子量及染色鉴定。 【实验原理】 电泳 带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。 PAGE 聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。 SDS是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。 解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。 SDS：在PAGE中，蛋白质的迁移率取决于它所带的净电荷的多少，分子的大小和形状。如果在PAG系统中加入阴离子去污剂SDS（十二烷基磺酸钠），蛋白质分子表面完全被负电荷所覆盖，电泳时，其迁移率取决于蛋白质的分子量大小而与其所带电荷和形状无关。 当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时， 蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系： lgMW=K- bm 将已知分子量的标准蛋白质在SDS中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。 浓缩效应 浓缩胶pH6.7 浓缩胶缓冲液Tris-HCl, 电极缓冲液Tris-Gly 解离度 ：?Cl ?蛋 ? Gly mcl?clm蛋?蛋m Gly ?Gly 凝胶中Cl－为快离子， Gly－为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。 浓缩效应 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 浓缩效应 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 浓缩效应 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 浓缩效应 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 分子筛效