细胞培养技术的应用与前景讲述.ppt

播报人：周亮 制作人：刘国兴 材料收集：鲍岛 费景龙 概述 细胞生物学、分子生物学以及免疫学是现代三大前沿生物科学，发展异常迅速。细胞培养是细胞生物学研究中最常用的方法之一。由于在体外培养中和机体内，细胞行为的基本规律是一样的，因此许多研究可以在体外进行。更重要的是，在培养条件下，人们可以有目的的、有选择地控制细胞生长的环境，因此可以研究在某些特殊条件下的细胞生物学行为。本讲主要目的是介绍动物细胞培养技术及其应用。 一 分类 1.组织培养(Tissue Culture)指的是从体内取出组织摹拟体内生理环境,在无菌 、适当温度和一定营养条件下,使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。 2.细胞培养(Cell Culture):培养物是单个细胞和细胞群。 3.器官培养（Organ Culture）：培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官,使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法. 历史 体外培养技术的发展大致可分三个时期：50年代之前是细胞培养在多个领域发展期； 50年代是细胞培养迅猛发展期，多种培养技术相继建立； 50年代后是体外培养技术与生命科学其他技术结合发展的新时期，诞生了多种培养的应用技术。 1)细胞内部的种种活动,如DNA的复制和转录、蛋白质合成、能量代谢; 2)细胞内部的流动,如RNA从细胞核向细胞质方向运转,激素受体复合物的易位等; 3)生态学,如营养、感染、病毒或化学诱变、药物作用; 4)细胞与细胞之间的相互作用,如胚胎诱导、细胞群体的动力学等. 1）理化环境可以调控 2）细胞经过多次传代培养形成细胞系，其特征基本相同，对外界影响因素的反应也较为一致。 3）培养物可直接暴露在预测的试剂中，预测样品用量少，并可直接观测反应。 4）可通过繁殖扩增，提供大量均匀的细胞备用，供比较不同因素或同一因素不同剂量对同一细胞株的作用。 5）可以人工筛选具有一定特征变异的细胞株或细胞融合，有利于基因功能的研究。 6）组织培养结合缩时电影技术，可以直接观察细胞的活动和对外界作用的反应。 体内外细胞的差异 当人工条件和体内实际情况不完全相同时,细胞在体外培养后,一旦失去神经体液调节和细胞间相互影响,生活在缺乏动态平衡的环境中,发生变化则是必然.细胞最多见的表现是:返祖（Atavism）现象——失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、细胞趋单一化、不死性、恶性状。 培养细胞的分化 不适应（Deadaption）——细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显。例如肝细胞在体外丧失了产生酪氨酸转移酶的特性. 脱分化和去分化（Dedifferentiation）——由于基因变异而使细胞失去分化能力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基酸转移酶的特性后,储存肝糖元的能力丧失,并很难再现. 所以说,不适应和脱分化两个概念不同.不适应是因为生存条件改变而使分化发生抑制;从分子水平考虑,脱分化很可能是基因变异所致. 培养细胞的形态 1.贴附型： 1）成纤维细胞：心肌细胞，血管内皮细胞等 2）上皮型细胞：消化管外皮细胞，肝脏上皮细胞等 3）游走型细胞：神经胶质细胞 4）多形型细胞：神经组织细胞 2.悬浮型：如癌细胞和血液白细胞 组织培养细胞的生长和增殖 1.原代培养（Primary Culture）阶段：原代培养也称初代培养，严格的说即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养 ，随不同的组织时间长短不一，一般为1-4w。 2.传代培养（Subculture）阶段：或称继代培养。也就是细胞系（Cell line）阶段。细胞增殖旺盛，一般细胞可传代10-50代）。 二倍体细胞系（Diploid cell line）：即细胞保持二倍体核型。 3.衰退阶段： 细胞增殖减慢或不增殖，甚至最后凋亡。但少数情况下，在这三期的任何一点，由于某种因素影响，细胞发生自发性转化。（物理 化学 病毒等因素〕 1）潜伏期（Latent phase）：细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。2倍体细胞该期时间长（24-96h），连续细胞系时间短（10-30min）。 细胞培养中应注意的几个问题 1）培养液和培养物:一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长,不能盲目增加每单位体积的细胞浓度. 2）PH:7.2-7.4 7.6或6.0 细胞损伤、退变或死亡 3）培养瓶内的空间:一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:10. 4）容积、深度、表面面积:培养液体积与表面面积的比例为0.2-0.5ml/cm. 5）去除死细胞: 6) 温度控制：动物细胞培养对温度波动较为