第七章 常见的色谱分离技术幻灯片.pptVIP

第七章 常见色谱分离技术;色谱又称层析 1903，俄国植物学家Tsweet分离植物色素时使用。;一、概念;二、原理;三、基本特点;;四、缺点;五、色谱法的分类;;六、凝胶色谱;根据待分离物质的分子量大小不同、在凝胶内流过的速度存在差异而进行分离。;1、分子量大的溶质组分完全不能进入凝胶颗粒内的孔隙中，只能经过凝胶颗粒之间的孔隙随溶剂移动。当流完自由空间后就从柱的下端流出。 2、分子量小的组分，可渗入凝胶颗粒内的孔隙中。因此在流完自由空间和全部凝胶颗粒的内空隙之后，才从柱的下端流出。 3、介于大小分子之间的组分，只能进入一部分颗粒内较大的孔隙，淋洗时此组分是流过全部自由空间加上它能进入的颗粒内孔隙，才从柱的下端流出。 在这一色谱柱的淋洗过程中，大分子的流程短，移动速度快，先流出色谱柱；小分子的流程长，移动速度慢，后流出色柱；而中等分子居两者之间。;Φ分子Φmax：全排阻 Φ分子＜Φmin：能进入凝胶的全部空隙;（二）凝胶色谱理论;1、大分子：完全排阻于凝胶颗粒之外;外水体积（Vo）的测定：蓝色葡聚糖-2000（全排阻）的洗脱体积； 内水体积（Vi）的测定：黄色铬酸钾（Φ分子＜Φmin）的洗脱体积减去外水体积（Vi = Vo - Ve）； 柱床体积（Vt）的测定：;（三）凝胶过滤介质;③ 、Sephadex G-50 G表示不同规格型号的葡聚糖； 数字50：代表交联度，数字越小，交联度越大； 数字50：还表示凝胶得水值的10倍，即每克凝胶膨胀时吸水5克。 ④、8种型号：G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200 ;（2）、琼脂糖凝胶 （Sepharose，Bio-Gel-A） 为半乳糖的线性多聚体，依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。 使用条件：0-40℃，pH4-9使用 优点：分子量的使用范围宽 缺点：适用于分离分子量差距较大的分子，即分辨率不高。;（3）、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P） ①、单体：丙烯酰胺 ②、交联剂：甲叉双丙烯酰胺 ③ 、型号：从P-2至P-300共10种， 如：Bio-Gel P-2， 2再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度，即该凝胶的排阻限度为2000Da。;聚丙烯酰胺凝胶;（1）、排阻极限 指不能扩散??凝胶网络内部的最小分子的分子量 如：Sephadex G-50的排阻极限：30kDa （2）、分级范围 能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的分子量范围 如： Sephadex G-50的分级范围：1.5-30Da;（四）、操作方法;（1）凝胶种类的选择： Sephadex ①混合物的分离程度主要取决于凝胶内部微孔的孔径和混合物相对分子量的分布范围。 ②凝胶的颗粒粗细：细颗粒分离效果好;;;根据所需凝胶体积，估计所需干胶量： 一般，Sephadex吸水后的凝胶体积约为其吸水量的两倍 如：Sephadex G-50 1克凝胶膨胀时吸水5克—5ml 1克凝胶膨胀吸水后的凝胶体积约10ml;（3）凝胶的预处理;2、层析柱的选择;3、装柱;4、平衡;5、加样;1、加样量少时，A，B两种物质能完全分开； 2、加样量适中时，A，B两种物质刚刚分开； 3、加样量太大时，A，B两种物质部分分开；;; ;（四）、操作方法;7、检测和合并收集;蛋白质在280nm有紫外吸收。;8、脱盐和浓缩 脱盐：透析法 浓缩：聚乙二醇;9、凝胶的保存;（五）、凝胶层析的应用 ;4、高分子溶液的浓缩;六、凝胶过滤层析 七、离子交换色谱;（一）离子交换介质的性质;;;2、离子交换剂的种类;3、离子交换树脂的基本性质; ;; 离子交换剂的电荷基团对不同的离子有不同的结合力，一般来讲： ①、离子价数越高，结合力越大 Na+ Ca2+ Al3+ Si4+ ②、价数相同时，原子序数越高，结合力 越大 Li+ Na+ K+ Rb+ Cs+ ;;（三）离子交换介质的种类;;弱酸型阳离子交换树脂：酚羟基或羧基;根据电荷基团的解离度不同，分为;六、凝胶过滤层析 七、离子交换色谱;（四）影响离子交换吸附和解吸的因素;离子交换剂的选择;（2）、pH的影响;阳离子交换剂;（3）、离子强度的影响;（四）离子交换层析的操作;2、离子交换剂的预处理：带上所需平衡离子;3、装柱：防止出现气泡和分层;7、离子交换剂的再生、转型;H型树脂再生：HCl或H2SO4处理 Na型树脂再生：8-10%NaCl溶液流过失效的树脂，使Ca型还原成Na型。;再生;8、离子交换剂的保存; 离子交换剂的电荷基团对不同的离子有不