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大环内酯类抗生素诱导肺炎支原体耐药机制研究 　　摘要：目的：研究分析大环内酯类抗生素诱导肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）的耐药机制。方法：对临床收集的300份咽拭子标本进行MP的分离培养；应用药敏试验对MP分离株进行测定并筛选出大环内酯类抗生素的MIC耐药株；应用PCR扩增仪对MP特异性16S核蛋白RNA（16SrRNA）基因进行扩增与分子鉴定；以红霉素为例，设计PCR扩增作用其靶位23S核蛋白RNA（23SrRNA）基因，并对扩增产物进行全自动的DNA测序，将所测序列与NCBI中已登录的MP标准株M129的23SrRNA进行对比。结果：300份咽拭子标本共分离出40株MP，其中包括耐药株37株，敏感株3株。耐药菌株的阿奇霉素、红霉素、交沙霉素的MIC值均有所升高。3株敏感株以及MP国际标准株的FH 23SrRNA序列与已知基因库MP序列相同，其余37株耐药株的23SrRNA均发生基因点突变，其中31株的突变位点位于V区的中心环2063位，29株发生了碱基A―G的突变，2株发生了碱基A―C的突变；其余6株的突变位点位于中心环2064位（A―G）。结论：大环内酯类抗生素诱导MP的耐药机制主要为23SrRNA靶基因的碱基点突变，以2063位突变为主导，此基因突变点的MP对阿奇霉素、红霉素、交沙霉素的MIC值均有所升高。 　　关键词：大环内酯类抗生素；肺炎支原体；耐药机制 　　肺炎支原体是引起临床获得性呼吸道感染的主要病原体之一，尤其在儿童及青少年中较常见，由于肺炎支原体属于最小原核真核生物行列且无细胞壁，对头孢类抗菌素不敏感，对本研究中的大环内酯类较敏感[1]。然而，在近年来的临床中，经大环内酯类治疗无效的病例逐渐增多，且分离得到了耐药株，引起临床研究者的广泛重视。本文笔者旨在研究大环内酯类抗生素诱导肺炎支原体的耐药机制，现汇报研究结果如下。 　　1资料与方法 　　1.1肺炎支原体（MP）的分离培养 　　（1） 研究标本来源：选择我院儿科自2012年2月至2014年2月的呼吸道患儿的300份咽拭子，其中60份标本来自门诊患儿，240份标本来自病房患儿。 　　（2） MP培养基的制备：应用PPLO型基础培养基，加入10%鲜酵母浸液、15%新生的小牛血清、1%葡萄糖、0.4%的酚红指示剂以及青霉素G500 U/ml等。新鲜酵母浸液由儿研所制备提供，新生小牛血清由四川省华西生化制品厂提取生产，葡萄糖和青霉素G购自华北制药，0.4%的酚红指示剂来自北京市化学制剂公司。 　　（3） 接种培养方法：将收集的300份咽拭子标本接种于制备好的培养基中，混合均匀后将其放置于37℃的温箱中孵育，并针对性设置阳性对照。 　　若存在肺炎支原体的生长，将对葡萄糖发酵产酸，使得培养基的pH有所下降，从而指示剂的颜色发生变化，并与设置的阳性对照进行对比，培养基颜色由红变黄，即可作为有肺炎支原体生长的指征。 　　1.2 MP的药物敏感性试验 　　应用配制的MP液体培养基进行系列倍数比稀释药物，在各试管中加入同等量的浓度为105 CCU/m1的MP菌液，将其放置于37℃的温箱中进行孵育，可以对MP生长产生抑制的药物最低浓度为此药物的MIC。进入研究的药物分别为阿奇霉素、红霉素、交沙霉素标准品等，上述药物均有中国药品生物制品检定所生产。 　　1.3临床MP的分离株分子鉴定 　　应用PCR扩增仪对MP特异性16S核蛋白RNA（16SrRNA）基因进行扩增与分子鉴定。此研究中应用的PCR扩增仪属于套式结构类型，由克隆遗传技术研究单位提供。 　　1.4以红霉素为靶位的23SrRNA基因分析 　　应用PCR扩增仪（套式）对临床MP分离株的23S核蛋白RNA 　　基因进行扩增，对PCR扩增产物采用直接测序方法进行测序，将其所测序列与在NCBI体系已登录的标准型23SrRNA基因进行详细对比。 　　1.5统计学方法 　　本文的数值资料采用SPSS17.0统计软件进行分析。对研究中的37株MP耐药株的药物MIC值进行多个独立样本的秩和检验，配对样本及计数资料采用t检验，P0.05为差异有统计学意义。 　　2结果 　　2.1肺炎支原体的分离培养 　　临床收集的300份咽拭子标本中共分离出40株MP，分离的阳性率为13.3%。由于肺炎支原体在体外环境中营养要求苛刻，因此生长极为缓慢，培养时间为至少2个月甚至更多。分离得出的40株MP中，所需分离培养时间最长的1株耗时为96d，其中所需培养时间最短的1株为14d，平均的分离培养时间为（39.2±1.5）d。分离得出的40株MP菌株以及MP的国际标准株FH经过MP种特异性16SrRNA基因PCR（套式扩增仪）扩增均出现了417bp的目的标志性条带，可以证实所分离得出