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免疫细胞分离和保存技术 免疫细胞分离和保存技术 临床上的各种类型的免疫缺陷、自身免疫病以及肿瘤等疾病均可出现淋巴细胞或淋巴亚群的数量和功能的变化。因此用体外方法对机体具有免疫反应的外周血淋巴细胞及其亚群的数目或比例以及它们所显示的功能的强弱进行检测，是判断机体细胞免疫水平的一种重要手段。这对于临床认识疾病、探讨其发病机制、观察病情变化、判断预后、考核疗效和防治疾病等方面均有重要意义。 免疫细胞分离和保存技术 用途 体外进行细胞免疫检测 要求 分离的淋巴细胞纯度高、产量多，而且不丧失活性，同时也要求分离技术简单、操作方便。 免疫细胞分离和保存技术 原理 外周血液中红细胞和白细胞的比例在几百甚至上千比一，两类细胞的大小和密度不同，其沉降速度也就不同。利用自然沉降法、密度梯度离心法或二者结合，可以将淋巴细胞从血液中分离出来。 常用方法：葡聚糖-泛影葡甲胺密度梯度离心法（ficoll-hypaque density gradient centrifugation）。 分离特点：分离纯度高，可达95％，淋巴细胞约占90％，其中T淋巴细胞占80％，B淋巴细胞占4～10％。 分离原理： ficoll-hypaque混合溶液，又称淋巴细胞分层液，血液中各有形成分的比重存在差异，利用比重为1.077、近于等渗的ficoll-hypaque混合溶液（又称淋巴细胞分层液）作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新聚集。血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层液的上部；红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部；淋巴细胞密度稍低于分层液，故位于分层液界面上，这样就可获得淋巴细胞。 一、免疫细胞分离 以豚鼠为例，讲解免疫细胞分离实验及其具体步骤． 一、免疫细胞分离 采血前的准备 用注射器取3 ml淋巴细胞分层液于一试管中. 再用注射器吸取２ml的阿氏液，并保存在注射器中． 一、免疫细胞分离 心脏采血 取血前应探明心脏搏动最强部位，通常在胸骨左缘的正中，选心跳最显的部位作穿刺。针头宜稍细长些，以免发生手术后穿刺孔出血.因豚鼠身体较小，一般可不必将动物固定在解剖台上，而可由助手握住前后肢进行采血即可。 一、免疫细胞分离 取豚鼠抗凝血4毫升，加3毫升Hanks液使之稀释。加于3毫升淋巴细胞分层液液面之上（沿管壁轻轻加入，勿使两液相混）。 一、免疫细胞分离 2000转/分离心30分钟，吸淋巴细胞层到1.5ml离心管中加5倍体积的Hanks液，然后心（1500转/分离心10分钟）弃上清即成。 重复离心一次 离心之前一定要配平 一、免疫细胞分离 一、免疫细胞分离 用毛细吸管吸取界面处的淋巴细胞与单个核细胞，置于离心管中，用Ｈanks重复离心两次（1000r/min离心10min），最后用hanks液配成1×107个细胞/ml浓度的细胞悬液. 二、家兔红细胞分离 心脏采血 把采取的血液轻轻沿壁注入到试管中．并轻轻摇晃几次． 二、家兔红细胞分离 取家兔阿氏液混合的血液，以Hanks洗三次（2000r/min离心10分钟）。然后，将压积红细胞用Hanks液配制成1%悬液。 三、免疫细胞的保存和活力测定 1、分离细胞的保存? （1）短期保存? 用含有10%~20%灭活小牛血清的 Hanks、Tc-199、? RPMI?1640培养液可保存数周（2）长期保存及复苏 保存：在保护剂二甲亚砜中于液氮（-196℃)中保存。其过程是：先对需冻存的细胞作活细胞计数，低速离心后，取沉积细胞用含有10%二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬 液，分装于冻存管内，立即放入降温过渡站( -80℃)中，继而进行降温(-196℃)冷冻。 三、免疫细胞的保存和活力测定 复苏：将其从液氮中取出，立即放入40 ℃温水中，融化后加入10倍的培养液混匀，低速离心，洗去保护剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力。 2、细胞活力的检测? 常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞而使细胞着色（蓝色）。? 免疫细胞分离和保存技术 * *