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禽流感病毒中和实验及其他方法 　 （一）实验材料 1、中和反应实验材料 (1)病毒： 一般为鸡胚尿囊病毒液，进行中和实验前，需要进行病毒滴度（TCID50）的滴定。 (2)血清样品 包括待检血清和阳性以及阴性对照血清。人血清实验前需要56℃ 30分钟灭活，动物血清需RDE处理。－20 (3)MDCK细胞和细胞培养试剂 1)MDCK细胞（狗肾上皮细胞） 2)MDCK细胞培养液：DMEM+5%牛血清+抗生素，过滤除菌 500毫升 DMEM（修饰的Eagles培养基） 5.5毫升 100×抗生素（100单位/毫升青霉素+100微克/毫升链霉素） 5.5毫升 100×L－Glutamine（2毫摩尔） 25.5毫升 56℃ 3)胰酶 / EDTA (4)其它 1)平底96孔微量培养板 2)病毒稀释液：DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。 429毫升 DMEM 66毫升 7.5%牛血清白蛋白（BSA） 5毫升 100×抗生素 3)TPCK－胰酶（使用浓度为2微克/毫升） 4)固定液：80%的丙酮，即配即用，4℃ 400毫升 丙酮 100毫升 PBS，PH 7.2 2、ELISA实验材料 (1)抗体1：鼠抗流感病毒甲型核蛋白克隆抗体 (2)抗体2：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG (3)洗涤液：PBS+0.05%TWEEN－20 4升 PBS，PH 7.2 2毫升 TWEEN－20 (4)封闭液：PBS+1%牛血清白蛋白+0.05％TWEEN－20 867毫升PBS，PH 7.2 132毫升牛血清白蛋白 1毫升TWEEN－20 (5)底物和底物溶液： 常用的辣根过氧化物酶（HRP）所用底物为磷苯二胺（OPD） 底物溶液为PH5.0磷酸盐－柠檬酸缓冲液（0.05M） 底物和底物溶液：10毫克OPD 20毫升柠檬酸缓冲液（含0.015%双氧水） 即配即用 磷酸盐－柠檬酸缓冲液，PH5.0 58.8克 1升蒸馏水 用盐酸调节PH为5.0 加0.015%双氧水，（临用前加入） * 如果使用磷酸盐－柠檬酸缓冲液胶囊（Sigma）1个胶囊加入100毫升蒸馏水，临用前配制 (6)终止反应液：1N硫酸（28毫升浓硫酸+1升蒸馏水） 3、其他 细胞培养和酶联免役吸附实验的常用设备和仪器（参照英文讲义） 备注：A.以上实验材料购自Gibco,，Hyclone，Dynatech，KirkegaardPerry和Sigma公司，材料编号（CAT#）参照英文讲义。 B.实验材料的配制，例如0.25%的胰酶等，请参照黄桢祥主编的医学病毒学基础及实验技术一书。 （二）质量控制 病毒中和实验技术是一个相当复杂的过程，参与中和反应的因素有病毒、抗血清和宿主细胞。这些因素的变化都会影响中和实验的结果。因此，对中和实验的整个过程进行严格的质量控制。每次测定必须设立阳性和阴性血清对照，阳性和阴性细胞对照，以及对病毒使用剂量进行滴定。 1、血清对照 血清对照包括人或动物血清阳性和阴性对照。即血清中含有（阳性对照）或不含有（阴性对照）对测定病毒特异性的中和抗体。血清对照一般分装成多份，－20℃ (1)阴性血清对照 1）动物血清一般来自未免疫或未感染动物，即与待检血清同种动物的正常血清。 2）人血清一般来自与待检血清年龄相同的正常人群，该人群未曾暴露于待检病毒。 3）测定过程中，阴性对照血清与待检血清应处于相同稀释水平。 (2)阳性血清对照 1）动物血清一般来自免疫后或感染后动物。 2）人血清一般采用急性期和恢复期双份血清做对照。 * 人血清使用前须经加热灭活处理，动物血清则须经霍乱滤液RDE（即受体破坏酶）处理，以排除非特异性反应因素。 2、病毒和细胞对照 每次实验必须设立阳性和阴性细胞对照，以及对加入病毒工作液进行滴定检查，以便获得准确可靠的实验结果。 (1)阳性和阴性细胞对照 一般设立4个重复孔为阳性细胞对照，即将细胞与100倍组织细胞半数感染剂量（100TCID50）的病毒进行混合培养。同时设立4个孔为阴性细胞对照，即将细胞与病毒稀释液进行混合培养。 阳性细胞对照：50微升病毒稀释液+50微升病毒+100微升MDCK细胞。 阴性细胞对照：100微升病毒稀释液+100微升MDCK细胞 (2)病毒工作液滴度检查 一般第1孔加入含有200TCID50的100微升病毒液，然后