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流式细胞术 For FCM Training 流式细胞术？ 对于处在流动状态中的细胞或颗粒各项特性进行检测 流式细胞术 流式细胞仪的构造 液流系统 样本流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法 鞘液压力恒定，流速不变 通过调节样本压力调节样本进样速率 流式细胞仪的构造 光学系统 激发光学系统: 激发光源—激光 透镜和反射镜—将激光引导到检测区域 接收光学系统: 滤光片等—将产生的光信号引导到对应的光学接收器 流式细胞仪检测信号 通过流式细胞仪我们可以得到--- ? 相对细胞大小 （前向角散射光-FSC） ? 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 （侧向角散射光-SSC） ? 染色过细胞的相对荧光强度 （荧光-Fluoresent light） 前向角散射光（FSC） 前向角散射光（FSC） 侧向角散射光（SSC） 侧向角散射光（SSC） 散射光（FSC SSC） 散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异 ? 通常使用“散点图”来看散射光信号 ? 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据 Dual Parameter dot-plot 流式细胞仪检测信号 双色荧光散点图 FACSCalibur光路图 流式细胞仪的构造 电子系统 将光信号转化为电信号（模拟信号） 将模拟信号转化为数字信号 计算每个脉冲峰 和计算机连接以传出数据 光信号转换为电信号 电压脉冲的产生—模拟信号 计算一个电压脉冲峰 面积是对荧光光通量进行积分测量的结果 宽度=面积/高度，与颗粒通过激光照射区的时间成正比 特定参数可选择面积、宽度信号（DNA含量分析） 流式细胞仪的构造 数据的获取表现 专业软件中的数据表现 流式细胞仪的构造 分选系统 Review Review Questions 在仪器设置中调高 Red参数的电压，左图中群体会发生什么变化？ 1. 样本处理 细胞悬液： 直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小 灌洗液、体腔积液 培养细胞、细胞系 实体组织： 病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本 针吸组织：新鲜样本 2. 选择合适的荧光染料 ★ 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 ★ 激发光谱必须在探测器能够接收的合适范围内 ★ 根据抗原表达强弱选择荧光抗体 ★ 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 Fluorescein (FITC) Phycoerytherin (PE) Allophycocyanin (APC) 2. 选择合适的荧光染料 FACSCalibur光路图 2. 选择合适的荧光染料 2. 选择合适的荧光染料 2. 选择合适的荧光染料 3.染色 体积 温度 孵育时间 对照 4. 数据收集和分析 1) 画图（直方图，散点图） 2) 调整仪器设置到合适的状态 3) 寻找目标细胞 4) 我们可以得到怎样的结果？ 它们意味着什么？ 同型对照（Isotype control） 例：一个双色染色的实验 抗体A FITC，抗体B PE 对应的同型对照是IgG1 FITC,IgG1 PE 那么需要准备的是 阴性对照：细胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE 单阳性对照： FITC: 细胞加上Ab A FITC PE: 细胞加上Ab B PE 数据分析 设门 设定阴性与阳性群体的界限 确定阳性与阴性细胞群体 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数 如何设定阴性与阳性的界限 直方图 散点图 Thanks! 同型抗体为没有特异性，与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清的纯化IgG1或IgG2. 同型对照就是使用同型抗体进行平行实验，反映待测样本对抗体非特异性结合水平。 将光信号成比例的转换成电信号，并进行数字化处理后传入计算机 Linear Amplification Log Amplification or Voltage Time Voltage PMT电压 电信号 Laser Laser Laser Time Voltage Time Voltage Time Voltage 当微粒离开激光束时，脉冲减弱。 3 当微粒达到激光束中间时，脉冲达到最大强度或者高度，此时激光束和信号强度都最高。此时测定峰值强度或者脉冲高度。 2 当微粒通过激光束时，脉冲开始。