蛋白质的离纯化-2.pptVIP

2.蛋白质的盐溶和盐析 　盐溶（salting-in） ：低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为蛋白质的盐溶现象。 同浓度二价中性盐对蛋白质溶解度的影响比单价中性盐大的多。 　盐析（salting-out） ：当溶液中的离子强度达到一定的数值时（盐浓度高达一定数值时），蛋白质的溶解度开始下降，很多蛋白质可以从水溶液中析出，这种现象称为盐析。 3.有机溶剂分级分离法 与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮等） 能使蛋白质在水中的溶解度显著降低，在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。 　这种沉淀的主要原因是有机溶剂的加入改变了介质的介电常数。 4.改变温度分离蛋白质 0~40oC之间：大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加， 例外：0～25oC，人的血红蛋白溶解度随温度上升而降低。 40~50oC以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性。 一般蛋白质的分级分离操作一般都在0~4oC温度下进行。 （三）根据蛋白质电荷不同的纯化方法 主要方法： 电泳 离子交换层析 电泳概述 　由于蛋白质在指定的PH溶液中所带电荷和分子量不同，形状不同，在电场中泳动速度不同。 　因此根据这一原理就可以从蛋白质混合液中将各种蛋白质分离开来，所以电泳技术已成为分析、分离蛋白质的重要手段之一。 1.聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylaminde gel electrophoresis) PAGE电泳 它以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板（不连续体系）。 凝胶的浓度（孔径大小）、 缓冲液组分和离子强度、 pH以及电场强度都是不同的 浓缩胶 分离胶 样品浓缩成很薄的起始区带（0.1mm） 分离成单区带 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS) SDS:是用SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂（通常为巯基乙醇）先对待分离的蛋白质样品进行预处理（加热煮沸3－5分钟）。 通过加热和SDS可以使蛋白质变性：多亚基的蛋白质解离为单亚基。二硫键被切断。 SDS是带有负电荷的分子，所有结合SDS的蛋白质的形状近似于长的椭圆棒，全部带上了大量的负电荷。 电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响（全部由负极向正极移动），而主要取决于蛋白质分子量。 浓缩胶 分离胶 样品 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置 点样 浓缩胶 分离胶 样品 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置 2.毛细管电泳 ① 泛指高效毛细管电泳、毛细管区带电泳、自由溶液毛细管电泳和毛细管电泳。 ② 用途：分离多种生物分子，包括氨基酸、肽、蛋白质、DNA片段（例如合成的寡核苷酸）和核酸以及多种小分子，如药物、甚至金属离子。用样量5～30μl 1mg/ml溶液。 3.等电聚焦电泳 等电聚焦或称电聚焦，是一种高分辨率的蛋白质分离技术，它也可用于蛋白质等电点的测定。 蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质（如浓蔗糖溶液）中进行电泳的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个很窄的区带。 等电聚焦可以把人的血清分成40多个条带。此技术特别适用于同功酶的鉴定。只要它们的pI有0.02（甚至0.02）pH单位的差别就能分开。 实际上是利用缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个pH梯度。所用的缓冲液是低分子量的有机酸和碱的混合物，该混合物称之两性电解质。 等电聚焦电泳装置 当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH处，具有不同pI的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的pH处，达到分离的目的。 4.蛋白质的双向电泳（two-dimensional electrophoresis） 将等电聚焦电泳与SDS结合起来的电泳技术。 电泳方向 电泳方向 等电聚焦电泳 SDS双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。 所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。 是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。 特种多缓冲交换剂 PH 降低 混和蛋白质样品 特种多缓冲液 特种多缓冲液 收集 特种多缓冲液 收集 特种多缓冲液 依次收集不同的蛋白组分 5.层析聚焦(P310) 填充到层析柱中的树脂有阳离子交换型和阴离子交换型。 支持介质： 对蛋白质交换容量大 阳离子交换剂 阴离子交换剂 CM—纤维素(弱酸型) P纤维素(中强酸型) SE 纤维素(强酸型) SPSephadex(强酸型) AM—纤维素(弱碱型) PAB--纤维素(弱碱型) DEAE-纤维素(中强碱型) DEAE-Sephadex(中强碱型)