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高效液相色谱仪的工作原理 高效液相色谱仪的系统组成 高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。 储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内。 高效液相色谱的特点 　高压——压力可达150～300 kg/cm2。色谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。 　高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 　高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 主要分离类型 液-固吸附色谱：适用于分离相对分子质量中等的油性试样。 液-液分配色谱：主要根据流动相与固定相的极性差异分离。 离子交换色谱：应用于离子及可离解的化合物。 离子对色谱：离子结合形成疏水性离子化合物。 排阻色谱：按分子大小分离。出峰速度？ 亲和色谱：利用生物大分子与固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择分离。 高效液相色谱仪的应用 高效液相色谱法只要求样品能制成溶液, 不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。 由于HPL C具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用, 流出组分易收集等优点,因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。??? 液相色谱- 质谱连用技术受到普遍重视, 如分析氨基甲酸酯农药和多核芳烃等; 液相色谱- 红外光谱连用也发展很快,如在环境污染分析测定水中的烃类, 海水中的不挥发烃类, 使环境污染分析得到新的发展。 操作过程中应注意的事项 流动相 1、 流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围； 2、 水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质； 3、 使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相；A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。  样品 1、 采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒； 2、 用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液； 3、手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍； 色谱柱： 1、 使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等； 2、 使用符合要求的流动相； 3、 使用保护柱； 4、 如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。 5、 色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存； 6、 不要高压冲洗柱子； 7、 不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱； * 样品溶液中的各组分在两相(流动相、固定相)中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程, 各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。 柱体为直型不锈钢管，内径1-6mm,柱长5-40cm。发展趋势减小填料粒度和柱径以提高柱效。 硅胶层析后活性样品的液相分离图谱 色谱图示例 *