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第三章 细胞生物学研究方法 第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞组分的分析方法 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第一节 细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜技术 二、电子显微镜技术 三、扫描隧道显微镜 一、光学显微镜技术 ①光学放大系统，为两组玻璃透镜：目镜与物镜； ②照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片以控制光的波长范围； ③机械和支架系统，主要是保证光学系统的准确配制和灵活调控; 对任何显微镜来说，最重要的性能参数是分辨率，而不是放大倍数。 分辨率(resolving power):指区分开两个质点间的最小距离。这个距离越小分辨本领越高。人眼的分辨力约为100-200μm。 显微镜分辨率的大小取决于光源波长λ，物镜镜口角α（标本在光轴的一点对物镜镜口的张角）和介质折射率N;它们之间的关系是： D＝0.61λ/N.sinα 通常α最大值可达140°，空气中N＝1，最短的可见光波长λ＝450 nm，此时分辨率D＝292 nm，约0.3um。若在油镜下，N可达1.5，D则可达0.2um，所以普通光镜的最大分辨率是0.2 um。 由于N.sinα往往是一定值，要提高分辨力只有采用缩短波长的途径。 普通光镜样品的制备： 样品经过固定剂（如甲醛等）固定后，包埋到包埋剂（如石蜡等）中，然后切成厚约5um的薄切片。 样品在观察前一般要经过染色，不同的染料对某种细胞组分有特异的吸附，如伊红和美蓝能特异性地与不同蛋白质结合，而品红则能特异性地显示出DNA的所在部位。 这样便能形成足够的反差或产生不同波长的光谱以区分该种细胞组分。 （二）荧光显微镜技术 荧光显微镜技术是以紫外线为光源，使被检物发出荧光然后在显微镜下观察其形状极其所在位置的镜检术。因使用紫外线，波长大大缩短，固可提高分辨力。 荧光显微镜技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。 例如将标记荧光素的纯化肌动蛋白显微注射人培养细胞中，可以看到肌动蛋白分子装配成肌动蛋自纤维。 （三）激光共焦点扫描显微镜技术 普通荧光显微镜下，许多来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率降低： 激光共焦点扫描显微镜（1aser scanning confocal microscopy）大大减少了这种焦平面以外的光，它在某一瞬间只用很小一部分光照明，这一束光通过检测器前的一个小孔或裂缝后成像，保证只有来自该焦平面的光成像，而来自焦平面以外的散射光则被小孔或裂缝挡住。 激光共焦点扫描显微镜成像异常清晰，分辨率可以比普通荧光显微镜的分辨率提高1.4～1.7倍。 激光共焦点扫描显微镜可自动改变观察的焦平面，而且纵向分辨率（axial resolution）得到改善，所以可以通过“光学切片”观察较厚样品的内部结构。将改变焦点获得一系列细胞不同切面上的图像，经叠加后便可重构出样品的三维结构。 二、电子显微镜技术 （－）电子显微镜的基本知识 电子显微镜在基本原理上与光学显微镜完全不同，构造也要比光学显微镜复杂得多，但其光路图却十分相近 1．电子显微镜与光学显微镜的基本区别 使用了波长比可见光短得多的电子束作为光源，波长一般小于0.1 nm。由于光源的不同，又决定了电镜与光镜的一系列不同点： 用电磁透镜聚焦；电镜镜筒中要求高真空；图像需用荧光屏来显示或感光胶片作记录。它们的基本区别见表。 3．透射电子显微镜的基本构造 ①电子束照明系统：包括电子枪、聚光镜。由高频电流加热钨丝发出电子，经高电压使电子加速，经过聚光镜汇聚成电子束； ②成像系统：包括物镜、中间镜与投影镜等。它们是若干精密加工的中空圆柱体，里面装置线圈，通过改变线圈的电流大小，调节圆柱体空间的磁场强度。电子束经过磁场时发生螺旋式运动，最终的结果如同光线通过玻璃透镜时一样，聚焦成像； ③真空系统：用两级真空泵不断抽气，保持电子枪、镜筒及记录系统内的高真空； ④记录系统：电子成像须通过荧光屏显示用于观察，或用感光胶片记录下来。 （二）主要电镜制样技术介绍 1．超薄切片技术 由于电子束的穿透能力有限，为获得较高分辨率，切片厚度一般仅为40～50nm，即一个直径为20 um的细胞可切成几百片，故称超薄切片。 超薄切片要求样品既要有一定刚性又要有一定韧性，而生物样品并不具备这些特性。 为此，样品往往需要包埋在特殊的介质中。但包埋的过程会破坏样品的结构； 所以超薄切片样品制备的第一步就是样品的固定，以便更好地保持细胞的精细结构。 （1）固定 ：不仅要求保持样品的形态结构不发生改变，有时甚至要求在超微和分子水平上使细胞内部的结构和组分保持在原来的位置上，同时尽量保持原来的性质，如抗原性等。 超薄切片常用的固定剂为锇酸（OsO4）和戊二醛等（表3－2）。 （2）