酵母菌分离鉴定要点.docVIP

酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵 (马飞龙 2011级生物类创新班联系方式 前言 酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸入细胞内，在无氧的条件下，经过体内酶的作用，把单糖分解为二氧化碳和酒精。此作用即酒精发酵。 C6H12O6(葡萄糖)→2 C2H5OH(酒精)+2 CO2↑ 在酿酒酵母酒精发酵的生产和应用中，由于细胞破碎和酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，从而降低产酒精效率。而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题。微生物细胞固定化方法主要有三种：载体结合法，交联法和包埋法，其中固定包埋法是目前比较理想的方法。包埋法就是将微生物细胞均匀地包埋在多孔的水不溶性的紧密结构中，细胞中的酶处于活化状态，因而活性高，活力耐久。目前，利用聚乙烯醇（PVA）—海藻酸盐是包埋法中比较高效的一种，这种方法以PVA-海藻酸钠作为混合溶胶，将酵母细胞固定起来进行酒精发酵，不仅可以使细胞浓度增加，而且可以多次使用，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；操作简单、过程迅速、颗粒不粘连、颗粒强度大大提高，且增加了颗粒的生物活性和稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。 1 摘要： 酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内4 ℃下保存。用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。[1] 关键词：酵母菌 分离鉴定 固定化 酒精发酵 2 材料与仪器 2.1材料 2.1.1酵母菌的分离与培养 成熟葡萄 试剂：0.1%吕氏(Loeffier)美蓝染液 配制方法：A 液：美蓝(methylene blue, 又名甲烯蓝)0.3 g, 95%乙醇30 ml； B 液：0.0l% KOH l00ml。 混合A 液和B 液即成，根据需要可配制成稀释美蓝液。 培养基： a.乳酸豆芽葡萄糖培养液（300 ml）：豆芽（60 g）、葡萄糖（6 g）, pH 值4.5。 配制方法： 　　1）先将豆芽称60 g加蒸馏水300 ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至250 ml左右 ，制成20%的豆芽汁； 　　2）加入葡萄糖，用乳酸调pH值至4.5左右，然后加蒸馏水定容至300 ml； 3）分装9 ml于小试管中，高压蒸汽灭菌于，115 ℃，20 min。 b.YPG培养基（500 ml）：酵母膏（5 g）、蛋白胨（10 g）、葡萄糖（10 g）、琼 脂（10 g）、pH值6.5～6.8。 　 （1）乳酸豆芽葡萄糖培养液（300 ml）：豆芽（60 g）、葡萄糖（6 g）, pH 值4.5。 　　配制方法： 　　1）先将豆芽称60 g加蒸馏水300 ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至250 ml左右 ，制成20%的豆芽汁； 　　2）加入葡萄糖，用乳酸调pH值至4.5左右，然后加蒸馏水定容至300 ml； 　　3）分装9 ml于小试管中，高压蒸汽灭菌于，115 ℃，20 min。 （2）YPG培养基（500 ml）：酵母膏（5 g）、蛋白胨（10 g）、葡萄糖（10 g）、琼脂（10 g）、pH值6.5～6.8。 　　配制方法： 1）称取酵母膏5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，放入500 ml烧杯中，然后加入400 ml蒸馏水； 2）使用HCl及NaOH调整pH值 6.5～6.8，加蒸馏水定容至500 ml，再放入琼脂10 g； 3）装入三角瓶，塞上棉塞，用报纸包扎瓶口。高压蒸汽灭菌，于115 ℃，20 min，冷却至50-55℃左右时倒入无菌平皿。 配制方法： 1）称取酵母膏5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，放入500 ml烧杯中，然后加入400 ml蒸馏水； 2）使用HCl及NaOH调整pH值 6.5～6.8，加蒸馏水定容至500 ml，再放入琼脂10 g； 3）装入三角瓶，塞上棉塞，用报纸包扎瓶口。高压蒸汽灭菌，于115 ℃，20 min，冷却至50-55℃左右时倒入无菌平皿。 2.1.2发酵