生物化学实验-3.pptVIP

层析技术 4.1 层析技术概述 4.1.1 引言 层析法亦称层离法或色谱法（Chromatography），它从发明至今已有一个多世纪的历史。1903年俄国植物学家茨维特（M. Tswett）首先使用此法分离植物色素。他向填充有CaCO3粉末的柱内加入植物色素提取液，并以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分开，柱上端呈黄色，较下端呈绿色，出现了不同颜色的谱带。后称之为色谱。由chroma（色彩）和graphs（图谱）构成色谱一词，层析法由此而得名。 但是，当时这种方法并没引起人们太多的关注，直到1931年R. Kuhn用此法从蛋黄中分离出黄体素、从玉米中分离出玉米黄色素开始，层析技术才逐渐引起了人们的重视。此后1941年Martin用具有亲水能力的硅胶介质填充的层析柱分离氨基酸成功，并提出了液-液分配层析最初的塔板论。 英国生物学家Martin和Synge根据塔板论，提出了远见卓识的预言：一、流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数)，这将会大大提高分离效率。前者预见了气相色谱的产生，并在1952年诞生了气相色谱仪，它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革；后者预见了高效液相色谱（HPLC）的产生，在60年代末也为人们所实现。80年代后期，人们在气相层析技术和液相层析技术的基础上还发展了超临界色谱。现在它们已成为生物化学与分子生物学、化学等领域不可缺少的分析分离手段。因此, Martin和Synge于1952年被授予诺贝尔化学奖。 4.1.2 层析的两个重要理论 层析法是一种利用混合物中各组分的物理、化学及生物学特性的差异，使各组分以不同程度分布在两个相中，即固定相和流动相，当流动相流过加有样品的固定相时，各组分所受固定相的阻滞作用和受流动相的推动作用的影响各不相同，从而使各组分以不同速度移动而达到彼此分离的目的。 （1）塔板理论 层析分离技术的目的是要将混合样品中各组分彼此分开，它遵循相似相溶的原理，在互不相溶的两相（固定相和流动相）之间进行分配。根据塔板理论，可以把层析柱设想由若干个层（即塔板）组成，被分离组分在每一个层（塔板）里的两相之间达到一次平衡，就进行了一次分配，相当于经过一个层（塔板）高。在分离过程中组分要达到多少次平衡，进行了多少次分配，应经过多少个层（塔板）高。理论塔板数量是衡量物质在柱内的分配次数，分离次数越多物质的分离效果越好。这样分配系数小的组分和分配系数大的组分就能彼此分开，分配系数小的组分每次达到平衡的时间短，从层析柱中先流出；分配系数大的组分每次达到平衡的时间长，从层析柱中后流出。 对于一个层析柱来说，可作如下基本假设： 1. 层析柱的内径和柱内的填料是均匀的，而且层析柱由若干层组成。每层高度为H，称为一个理论塔板。层析柱的长度用L表示。 2. 每个塔板内溶质分子在固定相与流动相之间瞬间达到平衡，且忽略分子纵向扩散。 3. 溶质在各塔板上的分配系数是一常数。 4. 流动相通过层析柱可以看成是脉冲式的间歇过程（即不连续过程）。 5. 溶质开始加在层析柱的第零塔板上。 根据以上假定，将连续的层析过程分解成了间歇的动作，这与多次萃取过程相似，一个理论塔板相当于一个两相平衡的小单元（一次萃取）。则理论塔板数量n为：L/H （2）速率理论 根据上述假设，塔板理论初步阐明了组分在层析中的迁移速度。它可以定量地描述层析柱的柱效率等。对层析技术的发展起了重要的推动作用。但是塔板理论采用的是平衡过程的研究方法，忽略了许多动力学因素对柱分离效率的影响。实际上，层析分离与分子的扩散及运动速度是有关的，而且，同一溶质在不同流动相流速下将具有不同的理论塔板数，所以，后来又发展了非平衡态的层析理论，或称速率理论。该理论吸收了层析的塔板理论的观点，同时又进一步把层析分离的分配过程与涡旋流扩散、分子扩散及传质阻力三者的关系联系起来，提出了连续流塔板模型。 用Van Deemter方程表示影响塔板高度的因素。 H=A+B/u+Cu 其中，A、B、C分别表示涡旋流扩散、分子扩散和传质阻力的3种系数；u表示流动相线性流速。由上式可以看出，当流动相流速一定时，A、B、C越小，H也越小，理论塔板数越大，柱效就越高。 下面我们来讨论一下这三方面因素的影响。 涡旋流扩散（A） 流动相中的组分由于受到固定相颗粒的阻碍，不得不从各种无规则的固体颗粒之间的间隙绕行，迫使其流动的方向不断发生改变，称为涡旋流扩散。由此可见，涡旋流现象的发生是由于固定相的颗粒大小不均匀及填充柱的不均匀引起各组分在层析柱中所发生的位移不同。它与流动相的性质、流速及组分的性质无关。因而，层析最好