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细胞培养的常见问题及解决方案 王德选 两种实验的优缺点 动物实验 细胞培养 活细胞 条件控制 样本均一 研究内容便于观察、检测、记录 研究范围广，费用相对经济 缺乏神经和内分泌调节，不稳定 问题零：我可以养细胞吗？ 阅读细胞培养相关理论及实验平台培训 细胞种类及培养条件的确立 参考文献，专业书籍及网站，询问他人，参考类似细胞的培养 原代培养或购买细胞株，请有经验的老师指导操作 问题一：怎样做到不污染？ １、为细胞培养工作创造一个良好的洁净环境 必备消毒器械：培养瓶，吸管，离心管等与细胞培养相关的器械 酒精灯，试管架，剪刀，镊子，废液缸等 常备物品：酒精棉球，75%酒精喷雾瓶，消毒纸巾 以上物品选择固定的位置放好，以便随取随用。 问题一：怎样做到不污染？ １、工作人员培养成良好的工作习惯 定期为工作间做清洁， 75%酒精擦拭，过氧乙酸可防止霉菌污染 定期用75%酒精擦拭擦拭培养箱内的托盘，更换消毒水 工作区或工作台在实用前用紫外线照20-30分钟。 问题一：怎样做到不污染？ １、工作人员培养成良好的工作习惯 提前10分钟打开吹风机 工作人员操作前洗手，戴帽，戴口罩，手套 所用培养基等试剂从冰箱取出后用用75%酒精擦拭后再放工作台 试剂瓶开启后，要倾斜放在试管架上 操作过程中尽量减少谈话 问题二：怎样观察活细胞和死细胞 １、活细胞 透明，饱满，清晰 问题二：怎样观察活细胞和死细胞 １、死细胞 灰暗，无光泽 问题三：细胞在什么时候传代最好？如何掌握细胞生长密度？ 一般情况下，细胞在生长至完全汇合后就要传代，所有细胞都有一个共同要求，即不宜生长过密（也就是通常说的长老了），许多细胞系都有它的生长特点： 成堆成片的生长 成克隆样生长 问题三：细胞在什么时候传代最好？如何掌握细胞生长密度？ 有接触抑制的细胞，就要在它完全汇合前传代，即80%密度，不然细胞就会引起分化。 刚拿到细胞株怎么办？ 问题四：细胞消化时怎样掌握火候 细胞生长汇合密度为80%-100%时就要消化传代 消化液浓度：0.05%T+0.02%EDTA 0.25%T+0.03%EDTA 消化液的PH:7.6-7.8 问题四：细胞消化时怎样掌握火候 细胞在消化前先加消化液，洗一下倒掉，再加消化液消化5-15分钟，细胞没有消化成园形时不要振动，待细胞完全变圆后，加新鲜培养基，按1:3或按要求分瓶。此过程一般不需要离心，培养基中的血清会中止消化液的活性。 有没其它消化方式，时间如何控制？消化液要吸出吗？ 常见问题：细胞没反应或消化过度怎么办？ 问题五：悬浮细胞如何传代？ 细胞密度在2×106，也就是掌握在生长至最大密度之前传代，方法:离心弃去旧液，加新鲜培养液将细胞混匀，然后分成3-6瓶（或按要求分瓶）。 问题六：细胞在培养过程中经常出现一些黑点点，是污染吗？ 肉眼观察液体是否浑浊 镜下观察黑点是否游动，要与布朗运动区别 细胞状态如何 以上都不是，可能属于以下情况 问题七：培养中黑点点是怎么形成的？ 细胞生长过老 使用的血清等试剂反复冻融 培养基的PH不合适 培养基配制过程中水质、容器不合格 如何防止黑点点是的生成？ 掌握细胞传代的最佳时机。 减少血清等试剂的冻融次数，培养基无需在37℃水浴（拿出放半小时） 培养基的PH调到最佳 (略酸PH7.0-7.2，特殊细胞特殊要求) 严格控制水质、容器严格洗刷 如何处理黑点点？ 慢速离心，换新瓶。（500-600prm 5min） 如果是贴壁细胞，用D-Hanks或PBS洗，或将细胞消化下来，移入离心管内慢速离心，然后弃上清，加入新鲜培养液继续培养 类似于层析的方法，先将5ml血清加入离心管，再将细胞悬液浓缩于1ml液体中，然后加入血清上层，慢速离心。 问题八：怎样让细胞适应新的条件？ 从原条件逐渐过度：原3/4新1/4 1:1 1/4 :3/4　　完全新培养基 换成新的培养基后应连续传三代再做实验比较稳定 以上实验应做对照 谢谢！ 支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0．2um)并独立生活的微生物．约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性．可为圆形、丝状或梨形。支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构．其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸、O 2或葡萄糖，每一种支原体都有自身持点。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7．6—8．0)，对酸耐受性差。对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。支原体污染细胞后．培养液可不发生混浊．多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由