总RNA的取及RT-PCR.ppt

RT-PCR技术 一、真核生物基因的表达 真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内含子（intron），真正编码蛋白的区段是被内含子隔开的，这些编码区叫做外显子（exon）。真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻译成蛋白质。 二、RT-PCR技术的应用 RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA酶的环境对于制备RNA很重要。 1.在实验室最好有专门的RNA操作区，离心机、移液器、试剂等专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行除菌。 2.相关耗材(Ep管、Tip头)应先用0.1% DEPC水浸泡过夜并高压消毒。也可直接使用厂家供应的无RNase的Ep管、Tip头。 3.金属器械和玻璃器皿应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 4.塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗 5.配制的溶液应尽可能加入DEPC至终浓度0.1%处理12hr以上，然后用高压灭菌除去残留的DEPC。（不能用DEPC或高压灭菌的试剂，如Tris、DTT等，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌） 6.人的唾液和汗液含有RNA酶，故在操作中应戴手套，避免讲话。 7.一些组织如脾脏比其它组织含有更多的RNA酶；细菌比哺乳动物细胞含有更多的RNA酶。因此从这些样本中制备RNA应采取更严格的预防措施。 Trizol是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。 RNA电泳鉴定 通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否有降解 电泳检测结果有三条清晰的rRNA 带：28S，18S和5S （普通的1%琼脂糖凝胶电泳也可用于鉴定，电泳槽用去污剂处理，水冲干净，用新鲜的电泳缓冲液） 实验二RT-PCR cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成： 第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录为cDNA，由逆转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用引物是oligo dT、随机引物或基因特异引物（GSP）。 第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。 方案示例： 0.1-1ug 总RNA 200一500 umol/L的dNTP (每种) 0.5umol／L 基因特异引物（上下游） 200 U AMV逆转录酶 1×Taq聚合酶缓冲液 0.5-15mmol／L MgCI2 1 mmo1／L DTT 1.5U Taq聚台酶 终体积为50ul。 半定量RT-PCR（semi-quantitative RT-PCR） 检测特定基因的表达水平，检测的手段 主要有Northern、半定量RT-PCR、荧光定量 PCR（realtime-PCR / Q-PCR）、基因芯片 等手段。 半定量RT-PCR是常用的一种简捷、快速、 特异的RNA定量测定方法。通过mRNA 反转 录成cDNA ，再进行PCR 扩增, 扩增产物以指 数形式增长, 通过测定PCR 产物的数量, 就可 以推测各样品中特异mRNA的相对含量。 虽然此法只能测定mRNA 的相对含量, 但 在比较模型组和对照组样品之间特异mRNA 的表达差异时足以说明问题. 1. 总RNA 的纯度和完整性鉴定 总RNA 提取之后，用紫外分光光度计测定其纯 度和浓度， OD260/ 280 应在1. 8～ 2. 0 之间；然后 再用1% 琼脂糖凝胶对总RNA进行电泳，以鉴定其完 整性，浓度不高、完整性不好的标本应谨慎选用，以 免影响后面的实验结果。 2. 内参基因 半定量RT-PCR需选用体内稳定表达且在其它生理条件下不受影响或影响很小的管家基因片段作为内参。 半定量 RT-PCR多以β-actin基因片段作内参，β-actin蛋白在各种细胞内的含量都稳定在10%左右。 另外常用的内参照还有GAPDH, 它是一种细胞 内代谢酶,