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腺相关病毒（AAV ）操作手册 目录 一、 AAV 安全注意事项 二、 AAV 储存和稀释注意事项 三、 AAV 介绍 四、 汉恒生物 AAV 产品服务及载体信息与现货列表 五、 AAV 整体实验流程 六、 实验材料 七、 AAV 载体构建 八、 AAV 包装 九、 AAV 收集和纯化 十、 AAV 滴度测定 十一、 AAV 感染细胞测试 十二、 AAV 用于动物实验 （重磅干货 ，五星推荐） 十三、 案例分享 附录 1 附录 2 一、AAV 安全使用注意事项 （*非常重要！！！* ） 1) AAV 相关实验请在生物安全柜（BL-2 级别）内操作。 2) 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。 3) 操作病毒时特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用 70%乙醇 加 1%的 SDS 溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请用 84 消毒 液浸泡后统一处理。 4) 如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。 5) 动物注射操作请在生物安全柜内（BL-2 级别）完成。 6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。 7) 实验完毕用洗手液清洗双手。 二、AAV 储存和稀释注意事项 1. AAV 的储存 收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于 4℃保存（一周内使用完最佳） ；如需长 期保存请分装后放置于-80℃。 注：a ．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融病毒滴度会降低 10%-50% ），因此在病毒使用过程中 应尽量避免反复冻融。汉恒生物已对病毒进行了分装（200 l/tube ），收到后请直接放置-80℃保存即 可。 b ．若病毒储存时间超过 6 个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度。 2. AAV 的稀释 需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用无菌 PBS 或生理盐 水混匀分装后置于 4℃保存(一周内使用完最佳)。 三、AAV 介绍 腺相关病毒（AAV ）属微小病毒科( parvovirus) ，为无包膜的单链线状DNA 病毒。 只有在腺病毒或者疱疹病毒等辅助病毒协助下，宿主才能产生具有感染性的 AAV ，所以 AAV 被称作腺相关病毒。典型的 AAV2 基因组约 4800bp ，包括 2 个反向末端重复序列 (ITR ，145 bp)和两个读码框(ORF)-Rep 和 Cap （图1 ）。ITR 对合成互补 DNA 链是必需 的；Rep 和 Cap 可以翻译成多种不同蛋白，如 AAV 生活周期必需的 Rep78、Rep68、 Rep52 和 Rep40 以及包膜蛋白 VP1、VP2 及 VP3 等。AAV 病毒系统就是用目的基因替 换掉 Rep 和 Cap ，然后与表达 Rep 和 Cap 基因的质粒共转 ，从而产生包含 目的基因的 AAV。目前 AAV 有 12 种血清型、100 多种变体。不同的血清型对组织或器官有着不同的 亲和性。由于安全性高、免疫原性小、表达周期久等优点，AAV 被称为目前最适合在体研 究 （in vivo ）基因功能的利器。 图 1、 AAV2 基因组结构示意图。 四、汉恒生物 AAV 产品服务及载体信息与现货列表 1. 汉恒 AAV 产品分类：  常规基因的过表达和干扰定制 （载体列表见 “七、载体构建”部分 ）；  组织特异性启动子过表达定制 （载体列表见“七、载体构建”部分）；  常规启动子和组织特异性启动子驱动的 AAV-Cas9 定制；  AAV 介导的光遗传、化学遗传载体现货及改造服务等 （见表 1 ）；  双标、单标 LC3 自噬流监测工具 （见表 2 ）；  组织特异性 AAV-DIO 载体的定制 （原理见附件 2 ）。 2. 汉恒 AAV 产品特点 ：  安全-AAV 不参与任何疾病的发生，已经用于临床疾病的治疗；  高效-病毒滴度高达 1013 以上，组织感染能力超强；  表达周期久-AAV