活血化瘀方药血塞通胶囊调控CD117造血干细胞生新血实验研究.docVIP

活血化瘀方药血塞通胶囊调控CD117造血干细胞生新血实验研究 　　[摘要]目的：探讨活血化瘀方药血塞通胶囊调控造血干细胞（hemopoietic stem cell，HSC）“生新血”的机制。方法：参照改良Zea-Longa法建立大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注损伤模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）。随机分为正常组、模型组、血塞通高、中、低剂量组；各组再随机按1，3，7，14，28 d时间点分为亚组。血塞通胶囊配置成20，40，60 g?L-1灌胃。正常组和模型组生理盐水灌胃，每天1次，直到实验结束。ELISA法检测不同时间点血液和骨髓中干细胞因子（stem cell factor，SCF）表达情况；流式细胞仪检测外周血和骨髓中CD117的变化。结果：模型组外周血和骨髓中CD117+HSC和SCF从1 d开始升高，14 d到高峰，其后逐渐降低。血塞通高、中剂量组外周血和骨髓中CD117+HSC和SCF在同一时间点上升的趋势明显优于模型组（P0.05）。结论：活血化瘀生新层面之“生新血”是通过调控CD117+HSC数量变化实现生新血目的。 　　[关键词]活血化瘀；血塞通胶囊；造血干细胞；脑梗死 　　造血干细胞是一种具有高度的自我更新，定向分化以及损伤后自我修复能力的干细胞，是维持体内血细胞数量稳定的细胞群体。CD117是干细胞因子受体膜外区分子表面抗原标志，仅表达于正常造血干/祖细胞，其配体干细胞因子（SCF）是重要的造血生长因子，在红细胞和多种白细胞的成熟过程中发挥重要的作用，在体内参与早期造血祖细胞的增殖、分化，可以趋化造血祖细胞迁移进入外周血并促进造血祖细胞分裂；课题组在前期研究基础上[1-4]，通过进一步研究活血化瘀法药物血塞通对外周血和骨髓中CD117+HSC数量上变化的调控作用，研究干细胞因子与CD117+HSC在外周血和骨髓中数量上的差异，揭示活血化瘀生新层面之“生新血”调控血液新生的机制，推动活血化瘀治法理论的发展。 　　1 材料 　　1.1 动物 健康Sprague Dawzey（SD）雄性大鼠158只，体重280～300 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京） 2006-0009，SPF级。饲养于河南中医学院动物实验中心，自由摄食和饮水，定期更换垫料，喂养1周后开始实验。 　　1.2 药品与试剂 血塞通胶囊（主要成分为三七总皂苷，昆明制药集团股份有限公司，国药准字；兔抗大鼠CD117多克隆抗体试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）；干细胞生长因子试剂盒（上海华壹生物科技有限公司，型号DT0921）。 　　1.3 仪器 LEICARM2535型石蜡切片机（德国LEICA公司）；SPS601F电子天平[梅特勒-托利多（常州）称重设备系统有限公司]；流式细胞仪；离心机（安微中科中佳科学仪器有限公司）。 　　2 方法 　　2.1 模型建立 参照改良的Zea-Longa[5]法建立大鼠MCAO模型。10%水合氯醛（350 mg?kg-1）腹腔麻醉，常规消毒，颈正中切口，分离左侧颈总动脉（CCA），颈外动脉（ECA）与颈内动脉（ICA），结扎ECA，CCA，在颈总与颈内分叉处系一活结。夹闭分叉口远心端，在CCA至ICA分叉口处剪一小口，将线栓送至ICA，计算栓线插入深度距离ICA，ECA分叉处[约（18±0.5） mm]。线栓尾部留在皮肤表面，逐层缝合皮肤，消毒伤口。术后大鼠侧卧，注意保暖。缺血2 h后，将线栓轻轻外抽，感到阻力时，表明线栓的头端已回到ICA的主干中，实现大脑中动脉的再灌注。连续3 d给予青霉素4万单位肌注抗感染，术后大鼠自由吃食、饮水。 　　2.2 分组与给药 术后存活24 h且出现左侧Horner′s征和右侧神经功能缺损的大鼠随机分为模型组、血塞通高、中、低剂量组。各组再随机按1，3，7，14，28 d时间点分为亚组，每亚组实验结束时仍有8只存活大鼠。根据《药理实验方法学》[6]所示体表面积剂量换算法结合前期预实验结果，血塞通胶囊配置成20，40，60 g?L-1，对应血塞通低、中、高剂量组，按体重10 mL?kg-1?d-1灌胃。正常组和模型组按体重10 mL?kg-1?d-1生理盐水灌胃，每天1次，到实验结束。 　　2.3 心脏灌注取脑 打开胸腔，从左心室插入导管至主动脉，快速注入37 ℃肝素化生理盐水，在右心耳部处剪一小口使血液自右心耳流出至冲洗液变清，再注入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液至鼠体抽搐变僵硬，固定时间约为10 min。断头取脑，取梗死侧大脑半球，放入4%的多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定，连续切取3 μm厚切片10张，备用。 　　2.4 腹主动脉取血 取各时间亚点大鼠予10%水合氯醛