X-连锁肾上腺-脑白质营养不良发病机制的研究-临床检验诊断学专业论文.docx

PAGE PAGE 3 X-连锁肾上腺-脑白质营养不良发病机制的研究 中文摘要 X-连锁肾上腺-脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy, X-ALD)是最常见的 过氧化物酶体脂质代谢病，由 ABCD1 基因突变所致。该疾病基因定位于染色体 Xq28，编码一个含 745 个氨基酸残基的蛋白质，称为肾上腺-脑白质营养不良蛋 白（adrenoleukodystrophy protein, ALDP）。由 ABCD1 基因突变引起的 ALDP 结 构改变或功能缺陷，使患者体内的极长链饱和脂肪酸（saturated very long chain fatty acid, VLCFA）不能进入过氧化物酶体进行 β-氧化，从而在血浆和组织中蓄 积，最终引起神经系统脱髓鞘和肾上腺皮质功能减退等病理改变。 本研究小组在对 30 多个 X-ALD 家系、100 多名家系成员进行 ABCD1 基因 突变分析时，检测出 4 名尚未出现临床症状的 X-ALD 患者；在国内首次报道 ABCD1 基因新生突变和散发性 X-ALD 病例；对 1 个 X-ALD 家系中的 2 名女性 杂合子患者进行了 X 染色体失活模式检测，并分析了突变型与野生型 ABCD1 基 因表达量之比，结果提示：由 X 染色体非随机失活导致的野生型 ABCD1 基因表 达量降低，可能是女性杂合子患者发病的原因。 为了研究 ABCD1 基因突变对 ALDP 结构和功能的影响，本研究利用公认的 生物信息学软件，构建了 ALDP 立体结构的计算机模型，对 ALDP 的结构功能 域进行了预测，并在此基础上，对本研究小组鉴定的多个错义突变进行独立的建 模，籍此为各特定突变对蛋白质稳定性的影响做出预测和评估。综合不同算法的 预测结果，上述突变均位于进化保守区域，大多突变会造成蛋白质稳定性降低， 易被蛋白酶体水解，从而无法行使正常的生物学功能，为致病性突变。 为进一步验证以上生物信息学预测的准确性，选择 R280L 和 L576P 两个突 变进行功能研究。利用分子克隆技术，构建野生型 ALDP 的真核重组载体： pEGFP-N2-ABCD1，并且通过人工诱导突变获得了 2 个突变体的真核重组载体： pEGFP-N2-ABCD1-R280L 和 pEGFP-N2-ABCD1-L576P。重组质粒转染 HeLa 细 胞后，荧光显微镜和免疫印迹均可检测到野生型 ALDP-GFP 融合蛋白表达，但 未检测到突变型 ALDP 表达，提示 R280L 和 L576P 突变可能造成相应的 ALDP 突变体稳定性下降，易被蛋白酶体水解。该结果与生物信息学预测一致。 本研究可为设计更好的 X-ALD 诊断、预防和治疗方法提供实验依据，并深 化对单基因遗传病发病机制的认识。 关键词：X-连锁肾上腺-脑白质营养不良 症状前诊断 新生突变 X 染色体 非随机失活 生物信息学 ABCD1 真核表达 Investigations in pathogenesis of X-linked adrenoleukodystrophy Abstract X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is the most common peroxisomal disorder, which is characterized pathologically by progressive demyelination of the central nervous system and the adrenal dysfunction. ABCD1 is the gene responsible for X-ALD, which lies on chromosome Xq28 and encodes a peroxisomal membrane protein of 745 amino acid residues called adrenoleukodystrophy protein (ALDP). Defect in the ABCD1 gene impairs the peroxisomal capacity to metabolize very long chain saturated fatty acids (VLCFAs) via β-oxidation, leading to accumulation of VLCFAs in all parts of the body, including the brain and adrenal glands. From 2001 to 2010, the ABCD1 gene from more than 30 unrelated C