βγ-晶状体蛋白与三叶因子复合物生物化学特性与作用机制研究-生物化学与分子生物学专业论文.docx

摘 摘 要 PAGE PAGE 4 摘 要 βγ-CAT 是一个从中国特有的两栖动物大蹼铃蟾 (Bombina maxima)皮肤分泌 物中分离得到的，由非晶状体βγ?晶状体蛋白(α-亚基, CAT-α)和三叶因子蛋白(β- 亚基, CAT-β)天然结合在一起形成的复合物，α-亚基与β-亚基通过非共价的方式 交联形成αβ2 ，分子量为 72-kDa。CAT-α的 N-末端部分(CAT-αN, 1-170 氨基酸残 基)是两个βγ-晶状体结构域，C-末端部分(CAT-αC)与产气荚膜梭菌ε毒素的膜插 入结构域有序列同源性。为了分析βγ-CAT 的βγ-晶状体蛋白结构域的生物化学特 性，我们在大肠杆菌中分别表达了 CAT-αN, CAT-αC 和 CAT-β。对天然纯化的 βγ-CAT 的免 疫共 沉淀 实验 表明 CAT-α 与 CAT-β形成 了一 个紧 密的 复合 物。 Pull-down 实验进一步证明重组表达的 CAT-β能结合在重组表达的 CAT-αN 上。 此外，我们还发现 CAT-αΝ具有钙离子结合模体，存在于其β-折叠构象上。重组 的 CAT-αΝ 可以结合钙离子探针铽离子，而且 CAT-αΝ在结合钙离子后构象没有 发生明显的改变。 近年来，研究发现血小板也会发生凋亡，并且这个凋亡过程可能在血小板清除中 起作用。βγ-CAT 在哺乳动物中体内会引起很多毒理学作用，通过血液学分析发 现βγ-CAT 会引起兔子体内血小板数量发生显著的下降。因此，为了研究βγ-CAT 对血小板的作用，我们将洗涤后的人血小板与不同浓度的βγ-CAT 孵育 30 分钟， 我们发现βγ-CAT 使人血小板表现出了多种凋亡特征，如 caspase-3 的激活，磷脂 酰丝氨酸外翻，线粒体膜电位去极化，细胞色素 c 的释放以及促凋亡蛋白 Bax 和 Bak 的表达上调。同时，通过血小板激活检测实验，如 P-选择素在人血小板表面 的表达，GPIIb/IIIa 的激活和血小板聚集等，发现βγ-CAT 在引起人血小板凋亡的 同时并不引起血小板的激活。 前期的研究表明,βγ-CAT 可以在人红细胞上形成寡聚体并具有很强的溶血活 性。我们通过实验进一步发现βγ-CAT (1 nM)可以引起红细胞内钙离子浓度急剧 升高从而引起溶血。 然而，在没有细胞外钙离子存在的情况下（反应体系中加入 20 mM EGTA）， 虽然βγ-CAT 引起的溶血得到显著抑制，但是βγ-CAT 仍然可以结合在红细胞膜上 并寡聚化。另外，我们发现βγ-CAT 在人血小板上引起的磷脂酰丝氨酸外翻和线 粒体膜电位的下降也是钙离子依赖的。综上所述，我们的数据表明 CAT-β（三叶 因子蛋白）和 CAT-αN（βγ-晶状体结构域）在体外可以相互结合，这为βγ-晶状 体蛋白与三叶因子的蛋白在体外形成复合物形成了结构基础。此外，CAT-αN 具 有钙离子结合活性，而且βγ-CAT 引起的溶血和血小板凋亡都是钙离子依赖的， 这为进一步研究βγ-CAT 生物学活性的作用机制提供了一个新的线索。 关键词：非晶状体βγ-晶状体蛋白，βγ-CAT，钙离子结合，血小板凋亡，溶 血，外钙内流 Ab Abstract ABSTRACT βγ-CAT is a naturally existing 72-kDa complex of non-lens βγ-crystallin (α-subunit, CAT-α) and trefoil factor (β-subunit, CAT-β), with a non-covalently linked form of αβ2 , identified from frog Bombina maxima skin secretions. The N-terminal part (CAT-αN, 1-170 residues) of CAT-α are two βγ-crystallin domains, while the rest C-terminal part (CAT-αC) shows sequence homology to membrane insertion domain of Clostridium perfringens epsilon toxin. To examine the biochemical characteristics of the βγ-crystallin domains of βγ-CAT, CAT-αN, CAT-αC and CAT-β were expressed in Escherichia coli, respectively