巴西橡胶树棒孢霉落叶病病菌蛋白激酶基因突变体SCCK1互补载体构建及转化.docVIP

巴西橡胶树棒孢霉落叶病病菌蛋白激酶基因突变体SCCK1互补载体构建及转化 　　摘要：为了明确蛋白激酶CCK1在巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌中的致病相关功能，在前期研究基础上通过PCR扩增，获得了该基因1 604 bp的5′端片段（L-C5）和131 bp的3′端片段（L-C3），同时以pCAMBIA3300质粒为模板扩增获得了552 bp抗性标记基因（L-Bar），并用In-Fusion HD Cloning Kit将L-Bar基因反向插入了L-C5和L-C3序列之间，克隆至pUC19载体上，成功构建了?SCCK1突变体的互补载体p?SCCK1-C。再从该载体上扩增互补片段，借助PEG介导法转化?SCCK1突变体的原生质体，经Basta平板筛选、PCR检测和测序鉴定表明，获得了?SCCK1突变体的互补转化子。为进一步明确CCK1基因在巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌中的致病相关功能打下了材料基础。 　　关键词：多主棒孢菌;蛋白激酶基因CCK1;?SCCK1突变体;互补载体;互补转化子 　　中图分类号： S435 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2015）04-0027-03 　　收稿日期：2014-10-15 　　基金项目：中西部高校项目（编号：ZXBJH-XK005）;海南大学青年基金（编号：qnjj1212）;海南大学科研启动基金（编号：kyqd1427）。 　　作者简介：曹申文（1990―），女，硕士研究生，主要从事植物病原真菌分子生物学研究。E-mail：hongshangcsw@。 　　通信作者：刘晓妹，博士，副教授，主要从事热带作物病害病原菌致病基因研究。E-mail：lxmpll@126.com。 　　由多主棒孢菌[Corynespora cassiicola （Bert.Curt.）Wei]引起的巴西橡胶树棒孢霉落叶病是巴西橡胶树的重要病害之一，现已在世界天然橡胶生产国普遍分布，该病害常造成橡胶树周年反复落叶，植株生长迟缓，枝条回枯或整株死亡，一般胶乳减产20%～45%[1-2]。目前，国内外对该病害的研究在病害诊断、病原菌生物学、病害流行学和防治技术等方面取得了较大进展[3-7]，但在分子生物学研究方面仅报道了4个致病相关基因CCK1[8]、CMP1[9]、CCHog1[10]、cas[11]，且大多处于序列特征分析阶段。其中，CCK1是本实验室从巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌中克隆获得的一个PMK1类促分裂原活化蛋白激酶基因[12]，经前期鉴定，初步确定CCK1基因可能在多主棒孢菌的菌落和菌丝形态、产孢、对环境的识别、毒素的产生以及致病性等方面起重要作用，并参与调控高渗胁迫反应[8]。但这些功能仍需通过互补突变体试验来进一步明确，而通过构建其互补载体和转化突变菌株获得互补菌株是关键步骤。本研究以Bar基因为抗性选择标记，用In-Fusion HD Cloning Kit成功构建了?SCCK1突变体的互补载体p?SCCKB，并转化了?SCCK1突变株的原生质体，获得 ?SCCK1 互补菌株，为明确CCK1基因的功能、揭示巴西橡胶树棒孢霉病菌致病机制打下了材料基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　供试菌株和质粒：巴西橡胶树棒孢霉落叶病病菌CC004菌株和含Bar基因的质粒pCAMBIA3300，均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。CCK1基因突变体 ?SCCK1 由笔者所在课题组提供。 　　供试试剂：Fungal gDNA Kit 和Mini Plasmid Kit 为BioMiga 公司产品;In-Fusion HD Cloning Kit为Clontech 公司产品;Peasy-T1和大肠感受态大肠杆菌（Escherichia coli） DH5α为TransGen Biotech公司产品;2×（HS）Taq-Mixture Kit 和TIANgel Midi Purification Kit为TIANGEN公司产品;核酸分子质量标准购自广东省广州东盛生物科技有限公司;GoldView DNA染料购自北京赛百盛基因技术有限公司;溶壁酶购自广东省微生物研究所;Ampicillin和Basta为Amresco进口分装;其他试剂为国产分析纯;引物合成和测序均由华大基因生物科技有限公司（深圳）完成。 供试引物见表1。 　　1.2 方法 　　1.2.1 基因组DNA的提取 接种巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌CC004菌饼于PD培养液中，28 ℃、150 r/min、黑暗摇床培养4～5 d，收集菌丝，用Fungal gDNA Kit提取基因组DNA。 1.2.2 ?SCCK1突变体的互补载体构建 先以野生菌株CC004的gDNA和质粒pCAMBIA3300为模板，分别