试验七土壤中微生物的分离及纯化设计性试验.PPTVIP

* 先用固体培养基制成无菌平板,然后将一定稀释度的少量样品(一般是0.2_0.5ml)加到平板上,并用无菌玻璃涂棒将菌液均匀涂布到整个平板表面,经过培养后挑取单个菌落. 是最常用的方法. * ＊利用选择培养基进行直接分离 根据微生物的特点，在培养基中加入一些抑制剂，使不需要的菌不生长，需要的菌生长后有一定特征，然后挑取单菌落。 分离抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平板上分离。 分离蛋白酶产生菌，可在培养基中加入牛奶或酪素，蛋白酶产生菌在平板上生长会形成透明的蛋白质水解圈。 ＊富集培养 主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，更容易从混杂的群体中分离到特定的微生物。 富集条件可从多方面选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等。 例如：分离产芽孢细菌，可以对样品进行高温处理，然后在进行培养。 实验七 土壤中微生物的分离及纯化（设计性实验） 一、目的要求 掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的基本操作技术。 学习平板菌落计数的基本原理和方法 。 初步观察来自土壤中的三大类群微生物的菌落形态特征 二、基本原理 在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。 为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。 土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。 但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony-forming?units，cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 三、器材 高氏1号琼脂培养基，肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，10％酚，无菌培养皿，链霉素，土样等。 大肠杆菌菌悬液、 牛肉膏蛋白胨培养基。lm1无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。 四、操作步骤----获得纯培养的方法 　1．稀释涂布平板法 　　（1）倒平板 将肉膏蛋白胨培养基、高氏1号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化，待冷至55～60℃时，向高氏1号琼脂培养基中加入10％酚数滴，向马丁氏培养基中加入链霉素溶液，使每毫升培养基中含链霉素30μg。然后分别倒平板，每种培养基倒三皿。 首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物. 这种方法适合于细胞较大的微生物. ①液体稀释法 活菌计数—混合倒平板法 2．平板划线分离法 　（1）按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称。 　（2）划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-1的土壤悬液一环在平板上划线（图Ⅶ-5）。划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。 ②平板划线分离法（Streak Plate） 特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品） An inoculating loop is used to thin out organisms on the surface of the agar. 连续划线 划线分离后平板上显示的菌落照片 划线方法 划线分离 划线分离 ③倾注平板法（Pour Plate） 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 9ml 9ml 9ml 9ml 一般选择每个平板上长有