人神经菌毛素_1基因重组腺病毒的构建与鉴定_郑见宝1_耿智敏2_陈强2_王林2.pdf

网络出版时间：2014-03-05 09:49 网络出版地址：/kcms/detail/61.1399.R0949.003.html 人神经菌毛素-1基因重组腺病毒的构建及鉴定 1 2 2 2 郑见宝 ，耿智敏 ，陈 强 ，王 林 （西安交通大学医学院第一附属医院：1.普通外科；2. 肝胆外科，陕西西安 710061 ） 摘要：目的 构建含有人神经菌毛素-1(NRP-1)基因和3Flag标签蛋白基因的腺病毒 载体，为研究该基因对肿瘤细胞与其周围间质细胞的相互作用的影响提供了实验基 础。方法 应用Age Ⅰ和Nhe Ⅰ限制性内切酶酶切含有人NRP-1基因的质粒，再将其 与酶切线性化的pDC315-3Flag载体片段连接，构建穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag ； 应用腺病毒骨架质粒pBHGlox△E1 ，3Cre与此穿梭质粒共转染HEK293细胞，产生重 组腺病毒，进而对重组腺病毒进行扩增、纯化及滴度测定；用PCR和基因测序方法 验证穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag的构建；再通过荧光显微镜和Western blot方法， 分别检测质粒pDC315-NRP-1-3Flag和重组腺病毒转染HEK293细胞后NRP-1蛋白的 表达情况。结果 经PCR和测序分析，证实穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag与设计一 致；穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag和重组腺病毒分别转染HEK293细胞后，经Western Blot均检测出在95～130ku处有条特征带，其大小和NRP-1-3Flag融合蛋白(104ku)相 吻合；滴度测定为2.00E+11PFU/mL 。结论 成功构建了人NRP-1基因重组腺病毒载 体，并能在HEK293细胞中表达。 关键词：NRP-1基因；重组腺病毒载体；肿瘤微环境 中图分类号：R735.7 文献标志码：A 文章编号：1671-8259 收稿日期：2013-06-08 修回日期：2013-09- 基金项目：国家自然科学基金资助项目（No；No）陕西省科学技术研究发 展计划项目（No.2011-K12- 19） Supported by the National Natural Science Foundation of China (No No）and Scientific and Technological Research Development Project of Shaanxi Province (No.2011-K12-19） 通讯作者：耿智敏，教授，主任医师. E-mail: gengzhimin@ 作者简介：郑见宝（1981- ），男（汉族），主要从事消化系肿瘤临床与基础研究. E-mail: bob.zheng@ Construction and identification of recombinant adenovirus vector of human neuropilin-1 gene 1 2 2 2 ZHENGJian-bao , GENG Zhi-min , CHEN Qiang , WANG Lin (1. Department of General Surgery; 2. Department of Hepatobilia