2种不同菌核形态猪苓its序列分析正文zvvehftq.docVIP

PAGE 引言 猪苓Polyporus umbellate (Pers.) Fries 属真菌门，多孔菌科，猪苓（地花）属，别名野猪粪，主要分布在我国河北、陕西、山西、四川、湖北、云南等地。陕西、云南产量较大，以陕西出产的猪苓质量最佳。猪苓主要生长在山林中柞树、枫树、桦树、械树、橡树的根上，同时喜在松软凸起不易长草的土壤中生长。猪苓菌核呈长形块状或不规则球形，稍扁，有的分枝如姜块，表面灰黑色或黑色，凹凸不平，有皱纹或瘤状突起，干后坚实，断面白色至淡褐色，半木质化，较轻。子实体由菌核内生出，有菌柄及菌盖。菌盖肉质，干后坚脆，圆形。担子短棒状，顶生4个孢子。 猪苓菌核的药用价值已有较多的研究报道。陈汝盛等证明猪苓龙葵水提物具有抗肿瘤作用[1]。曾星等通过观察BCG（卡介苗）和猪苓多糖作用后的巨噬细胞株J774免疫分子的表达，说明猪苓多糖具有协同BCG启动非特异性免疫反应机制的作用[2]。印利华采用自拟“复方茯苓猪苓汤”内服外用治疗复发性生殖器念珠菌病取得较好疗效，证明猪苓具有良好的抗菌作用[3]。张万水等通过临床应用猪苓汤证明其对膀胱结石、双膝关节退行性变、急性肾盂肾炎、肾功能不全（尿毒症期）有良好的治疗作用[4]。任玉兰等阐明猪苓多糖治疗慢性乙型肝炎有一定的疗效 [5]。李雪生等依据血水同源理论，采用猪苓汤治疗儿科临床上较常见的疾病急性渗出性中耳炎，疗效显著[6]。目前，对猪苓的生物学特性、栽培和药理作用等已有大量研究。 在真菌的分类上，由于真菌形态构造和繁殖方式较原核生物复杂、多样，但与高等植物相比形态结构则又简单,因此其分类既不同于原核生物也不能与高等植物相似。经过较长时间的发展,逐渐形成了以“形态结构特征为主、生理生化、细胞化学和生态等特征为辅”的分类原则。 随着分子生物学的发展,新的分子生物学技术的应用更新了系统学的研究。应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明真菌种群之间和种间内的分类学关系已是目前真菌分类学研究的热点，从过去依赖形态和生理生化等表型特征描述逐渐引入分子生物学鉴定方法，按其亲缘关系和客观的反映系统发育的规律对真菌进行自然分类，达到人们追求已久的自然分类目的，无凝是分类学发展过程中的重要转折。 分子生物学方法中的核酸序列分析是通过测定核酸一级结构中核苷酸序列的组成来比较同源分子之间相关性的方法，它能为物种提供最直接、最有价值及最为准确的信息，利用它不仅可直接地研究物种间的亲缘关系，而且对了解基因及其产物的结构、基因表达以及分子进化等方面具有重要意义。因此DNA 作为遗传物质要比表型特征更为真实地反应真菌的系统发育。目前常用的DNA 分子进行真菌分类的方法有: RFLP、RAPD、AFLP、SAP和PCR-ITS序列分析等几种方法。 RFLP 技术的依据是不同种、种内以及种群的DNA 序列在进化过程中发生突变，造成限制性位点的插入、缺失、重排或点突变。当将目标真菌的DNA 序列经一定数目和种类的限制性内切酶(RE) 进行酶切时, 由于不同的目标真菌DNA 序列结构有差异，内切酶在其上的识别位点的数目和距离就发生了改变，因而产生相当多的大小不等的DNA 片段, 在进行凝胶电泳时，它们由于迁移率不同形成不同的带，通过与克隆的DNA 探针进行Southern 杂交和放射自显影后，即产生和获得反映生物个体特异性的 RFLP 图谱。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ， EcoRⅠ，EcoRV，XbaⅠ等。RFLP 技术可将分类单位精确到种以下，可以用来对物种、变种、个体菌株及杂交种进行种性检测。 RAPD是一种有效的遗传标记技术，现已广泛应用于动植物及微生物的遗传变异、分子进化和基因组研究等领域。 该技术是在PCR技术基础上，利用一系列不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸链(通常为10 bp) 为引物，在DNA 聚合酶的催化下，以dNTP 为原料，对所研究基因组DNA 进行PCR 扩增。 所得扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，核酸染料染色后置于紫外灯光下检测其多态性。 如果被测基因组在扩增区域发生DNA 片段插入、缺失或碱基突变，那么扩增产物就增加、缺少而发生分子量的改变。通过一系列引物进行RAPD 分析，其探察区域可能覆盖大部分甚至整个基因组，其结果将比较全面地反映被测生物的DNA 多态性，从而可以反映生物间的亲缘关系。RAPD 在真菌上主要用于种群变异的研究和种间、种内、生理小种及专化型的区分，也用于真菌的系统学研究。 而PCR-ITS序列分析是PCR特异扩增ITS序列。这是目前鉴定物种和做分子分类研究的最主流的方法。原理是:ITS序列（internal transcribed spacer）是中度重复序列，位于rDNA/rRNA片段上，同时广泛分布于基因组中并且是同步进化的，而且不同物种