微小核糖核酸21反义寡核苷酸对人舌鳞癌细胞生长抑制体内研究.docVIP

微小核糖核酸21反义寡核苷酸对人舌鳞癌细胞生长抑制体内研究 　　[摘要] 目的 研究微小核糖核酸-21（miR-21）反义寡核苷酸（AS-miR-21）对人舌鳞癌生长的抑制作用。方法 采用稳定转染pGL6荧光素酶报告基因质粒的舌鳞癌细胞Tca8113-luc接种裸鼠，建立移植瘤动物模型，瘤体内注射AS-miR-21，应用活体成像和TUNEL等实验技术进行AS-miR-21对人舌鳞癌细胞系生长抑制的体内研究。结果 通过转染pGL6荧光素酶报告基因质粒构建了稳定表达荧光素酶活性的Tca8113-luc细胞株。裸鼠皮下荷瘤模型成瘤率高，肿瘤生长稳定。在瘤体内注射AS-miR-21后肿瘤生长减慢，活体成像中光子数偏低，肿瘤标本中坏死灶少见，细胞核变小，染色变浅，异型性减低，新生血管数减少。肿瘤组织中miR-21表达明显下降，凋亡指数升高。结论 肿瘤内注射AS-miR-21可以降低舌鳞癌细胞中miR-21的表达，促进舌鳞癌肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的生长。 　　[关键词] 舌鳞癌； 微小核糖核酸-21； 微小核糖核酸-21反义寡核苷酸； 基因治疗； 活体成像 　　[中图分类号] R 739.86 [文献标志码] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.002 　　靶向微小核糖核酸-21（micro ribonucleic acid- 　　21，miR-21）的反义寡核苷酸可以有效抑制舌鳞癌细胞的增殖，促进细胞凋亡，抑制细胞的迁移和侵袭能力。笔者采用稳定转染pGL6荧光素酶报告基因 　　质粒的舌鳞癌细胞Tca8113-luc接种裸鼠，建立舌鳞癌移植瘤动物模型，利用脂质体OligofectamineTM为载体，瘤体内注射miR-21反义寡核苷酸（antisense- 　　miR-21 oligonucleotide，AS-miR-21），应用活体成像和TUNEL等实验技术进一步进行AS-miR-21对人舌鳞状细胞癌细胞系生长抑制的体内研究。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 细胞系 人舌鳞癌细胞系Tca8113由上海交通大学口腔肿瘤生物实验室建立并提供。 　　1.1.2 siRNA oligo 根据microRNA数据库（http：//www.sanger.ac.uk）提供的基因序列，获取人miR-21的序列，依序列互补原理设计相应的反义寡核苷酸序列和随机对照序列，并采用BLAST软件分析，人工合成的寡核苷酸序列以2’O-Me修饰。AS-miR-21序列：5’-GUCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3’；Scrambled序列：5’-AAGGCAAGCUGACCCUGAAGU-3’。 　　1.1.3 质粒 pGL6荧光素酶报告基因质粒购自江苏碧云天生物技术公司，含有荧光素酶编码luc基因和G418抗性的Neo基因。 　　1.1.4 实验动物 BALB/c-nu（SPF）雌性裸小鼠，4～6周龄，体重15～18 g，共24只，购自北京大学医学部实验动物科学部。 　　1.1.5 主要试剂和仪器 LipofectamineTM及Oligofec-tamineTM Reagent（Invitrogen公司，美国），TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（南京凯基生物公司），精诺真活体动物体内可见光成像系统IVIS200及气体麻醉系统XGI-8（Xenogen公司，美国）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞处理方法 将Tca8113细胞常规复苏、传代，于37 ℃、5%CO2孵箱中培养，选用对数生长期、0.2%台盼蓝拒染率95%的细胞。 　　1.2.2 质粒扩增提纯及质粒酶切、转染 按德国Qia-gen公司大量质粒扩增纯化试剂盒要求扩增提纯pGL6荧光素酶报告基因质粒后，以Hind Ⅲ酶切并再次提纯，利用LipofectamineTM将其稳定转染Tca8113细胞。 　　1.2.3 细胞筛选及稳定表达荧光素酶基因细胞克隆的培养和鉴定 以G418筛选稳定表达荧光素酶基因的Tca8113-luc细胞，培养细胞克隆。倍比稀释细胞克隆，采用可见光成像系统成像，检测Tca8113-luc细胞荧光素酶基因表达效率，分析荧光强度与细胞数之间的相关性，绘制Tca8113-luc细胞生长曲线。 　　1.2.4 人舌鳞癌Tca8113-luc裸鼠模型的建立 将24只裸鼠随机分为空白对照（control）组、无义序列（Scr-miR）组和反义序列（AS-miR-21）组，每组8只。取对数生长期的Tca8113-luc细胞，调整细胞浓度至每毫升1×107个，每只200 μL接种于裸鼠右侧鼠蹊部皮下。 　　1.2.5 裸鼠荷瘤生长及治疗情况 接种肿瘤细胞第15天，23只裸鼠成瘤，成瘤率为95.83%，肿瘤大小