实验七 细胞骨架观察_附件.ppt

细胞骨架组分的荧光染色观察 实验目的 掌握细胞骨架的显示方法 掌握荧光显微镜的使用方法 了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构 背景知识 细胞参量 荧光探针 吸收/发射 nm 特性 DNA和RNA Propidum iodide(PI) 535/617 红色荧光 嵌入核酸双链间,只能标记死细胞.用于 染色体,细胞观察,分辨死活细胞和细胞周期研究 Ethidium bromide(EB)518/605 红色荧光 嵌入核酸双链间,只能标记死细胞.用于电泳分析,染色体观察 DAPI 358/461 蓝色荧光 半通透细胞,结合于DNA的AT碱基对.用于细胞周期的研究,染色体和细胞核的观察 Hoechst33342 350/461 蓝色荧光 结合于DNA的AT碱基对,可进入活细胞,用于细胞周期的研究,染色体和细胞核的观察 蛋白和抗体的耦联探针 FITC 494/518 绿色荧光 染死细胞,对PH值变化不敏感 Texas red 595/615 红色荧光 多参量细胞标记 溶酶体 Neutral red 541/640 红色荧光 探针微偏碱性,可标记溶酶体等酸性细胞器 线粒体 Rhodamine 123 507/529 黄绿色荧光 可进入活细胞,阳离子性,摄入快,淬灭快,无毒性 常用荧光探针介绍 狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管和中间纤维。 广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。 细胞骨架 * 微管 * 微丝 * 中间纤维 背景知识 S.D.Pone用考马斯亮蓝染人皮肤成纤维细胞的细胞骨架获得成功。1982年上海植物生理所陈梓卿采用植物细胞为材料也获成功。实践证明这是一种简单易行的方法。 当细胞用适当浓度的triton X -100溶液（聚乙二醇辛基苯基醚，一种非离子去垢剂）处理，能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而微丝束结合得比较紧密，不容易被去除 ，经固定和染色后，可在光镜下观察到由微丝组成的纤维束。 细胞骨架研究中常用药物 药物名称 作用 细胞松弛素B (cytochalasin B, CB) 结合在微丝的正端，阻抑其聚合，同时提高临界浓度，最终导致微丝的解聚 鬼笔环肽 (phalloidine) 强烈亲和微丝，结合在微丝中actin亚单位之间，稳定微丝、促进微丝聚合 秋水仙素（colchicine） 阻断微管蛋白组装成微管 紫杉醇（taxol） 促进微管的装配，稳定已形成的微管 实验原理 鬼笔环肽(phalloidin) 是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反, 只与聚合的微丝结合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后, 抑制了微丝的解体, 因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。 由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白, 因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响. 此外, 较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用. 因此, 用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法. G-actin F-actin ATP、 Mg2+、高K+、Na+ Ca2+、低Na+、K+ 实验步骤 材料： CHO（中国仓鼠卵巢细胞）、鸡胚成纤维细胞 试剂： 1.PEM：50mM pipes (pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 2.0.5% Triton X-100溶于PEM缓冲液中。 3.4%多聚甲醛溶于PEM缓冲液中。 取出盖片，于小平皿中37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL) Triton X-100处理约10min(1mL) 37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL) 37℃预温 4%多聚甲醛固定细胞15min (1mL) 37℃预温 PEM洗3次 55nM Alex -phalloidin 10?L湿盒中室温染色30min。 37℃预温 PEM洗数3次 滴加10?L Ho.33342复染色 用小砂轮切去长方形盖玻片的一角作为标记以便识别细胞面。 细胞密度60-80% 注意盖玻片的正反面 切勿产生气泡！ 在parafilm 膜上加PEM ，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片。 避光操作 荧光镜下观察 注意事项 注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面； 各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落； 荧光观察注意避光操作 节约试剂。 思考题 PEM缓冲液的作用是什么？ 0.5%Triton X-100处理细胞的作用是什么？ 鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优缺点是什么？